Het aantal eiwitten in het menselijk lichaam, gezamenlijk bekend als het proteoom, is enorm. Ergens tussen de 80, 000 en 400, 000 eiwitten circuleren in onze cellen, weefsels en organen, het uitvoeren van een breed scala aan taken die essentieel zijn voor het leven. Als eiwitten mis gaan, ze zijn verantwoordelijk voor een groot aantal ernstige ziekten.

Nutsvoorzieningen, onderzoekers van het Biodesign Center for Applied Structural Discovery en ASU's School of Molecular Sciences, samen met hun collega's, een kritisch belangrijke klasse van eiwitten onderzoeken, die de buitenmembranen van cellen sieren. Dergelijke membraaneiwitten werken vaak als receptoren voor bindende moleculen, het initiëren van signalen die het celgedrag op verschillende manieren kunnen veranderen.

Een nieuwe benadering voor het verkrijgen van structurele gegevens van membraaneiwitten in verrassend detail wordt beschreven in de nieuwe studie. Cryogene elektronenmicroscopie (of cryo-EM) methoden, een baanbrekende reeks tools, is gebruikt. Verder, het gebruik van zogenaamde LCP-kristallisatie en Microcrystal-elektronendiffractie (MicroED) helpen bij het onthullen van structurele details van eiwitten die grotendeels ontoegankelijk waren via conventionele benaderingen zoals röntgenkristallografie.

De bevindingen beschrijven het eerste gebruik van in LCP ingebedde microkristallen om structurele details van eiwitten met hoge resolutie te onthullen met behulp van MicroED. Het nieuwe onderzoek siert de omslag van het huidige nummer van het tijdschrift Cell Press Structuur .

"LCP was een groot succes bij de kristallisatie van membraaneiwitten, volgens Wei Liu, een corresponderende auteur van de nieuwe studie. "De nieuwe uitgebreide toepassing van LCP-MicroED biedt een belofte voor verbeterde benaderingen voor structurele bepaling van uitdagende eiwitdoelen. Deze structurele blauwdrukken kunnen worden gebruikt om nieuwe therapeutische geneesmiddelen te ontwerpen op basis van preciezere inzichten."

Een klasse van membraaneiwitten van bijzonder belang zijn de G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's), die de grootste en meest gevarieerde groep membraanreceptoren vormen die in eukaryote organismen worden aangetroffen, inclusief mensen.

De fysiologische activiteiten van GPCR's zijn zo belangrijk dat ze een belangrijk doelwit zijn voor een breed scala aan therapeutische geneesmiddelen. Hier ontstaan ​​echter problemen, omdat het bepalen van de gedetailleerde structuur van membraaneiwitten - een essentiële voorloper van nauwkeurig medicijnontwerp - vaak enorme uitdagingen met zich meebrengt.

De techniek van röntgenkristallografie is gebruikt om de structuren op atomaire schaal en zelfs het dynamische gedrag van veel eiwitten te onderzoeken. Hier, gekristalliseerde monsters van het onderzochte eiwit worden geraakt met een röntgenstraal, diffractiepatronen veroorzaken, die op een scherm verschijnen. Door duizenden diffractie-snapshots samen te stellen, kan met behulp van computers een 3D-structuurbeeld met hoge resolutie worden samengesteld.

Toch veel membraaneiwitten, inclusief GPCR's, vormen niet groot, goed geordende kristallen die geschikt zijn voor röntgenkristallografie. Verder, dergelijke eiwitten zijn kwetsbaar en worden gemakkelijk beschadigd door röntgenstraling. Om het probleem te omzeilen was het gebruik van speciale apparaten nodig die bekend staan ​​als X-ray Free Electron Lasers of XFELS, die een briljante uitbarsting van röntgenlicht kan leveren die slechts femtoseconden duurt, (een femtoseconde is gelijk aan een quadriljoenste van een seconde of ongeveer de tijd die een lichtstraal nodig heeft om de diameter van een virus te doorkruisen). De techniek van seriële femtoseconde röntgenkristallografie stelt onderzoekers in staat een brekingsbeeld te verkrijgen voordat het gekristalliseerde monster wordt vernietigd.

Hoe dan ook, kristallisatie van veel membraaneiwitten blijft een uiterst moeilijke en onnauwkeurige kunst en er bestaat slechts een handvol van deze gigantische XFEL-machines in de wereld.

Voer cryogene elektronenmicroscopie en MicroED in. Deze baanbrekende techniek omvat het flash-bevriezen van eiwitkristallen in een dun laagje ijs, vervolgens onderwerpen ze aan een bundel elektronen. Zoals in het geval van röntgenkristallografie, de methode maakt gebruik van diffractiepatronen, deze keer van elektronen in plaats van röntgenstralen, om definitieve gedetailleerde structuren te assembleren.

MicroED blinkt uit in het verzamelen van gegevens van kristallen die te klein en onregelmatig zijn om te worden gebruikt voor conventionele röntgenkristallografie. In de nieuwe studie onderzoekers gebruikten twee geavanceerde technieken in tandem om diffractiebeelden met hoge resolutie te produceren van twee belangrijke modeleiwitten:Proteinase K en de A2A-adenosinereceptor, waarvan de functies modulatie van neurotransmitters in de hersenen omvatten, cardiale vasodilatatie en T-cel immuunrespons.

De eiwitten waren ingebed in een speciaal type kristal dat bekend staat als een lipidische kubische fase of LCP-kristal, die de natuurlijke omgeving nabootst waarin dergelijke eiwitten van nature voorkomen. De LCP-monsters werden vervolgens onderworpen aan elektronenmicroscopie, met behulp van de MicroED-methode, die het mogelijk maakt om extreem dunne, kristallen van submicronformaat. Verder, continue rotatie van LCP-kristallen onder de elektronenmicroscoop maakt het mogelijk meerdere diffractiepatronen te verkrijgen van een enkel kristal met een extreem lage, schadevrije elektronendosis.

Het vermogen om eiwitten te onderzoeken die alleen micro- of nanokristallen kunnen vormen, opent de deur naar de structurele bepaling van veel vitaal belangrijke membraaneiwitten die conventionele onderzoeksmethoden zijn ontgaan, met name GPCR's.