Terwijl het nieuwe coronavirus zich blijft verspreiden, onderzoekers zoeken naar nieuwe manieren om het te stoppen. Maar voor twee wetenschappers, kijken naar de toekomst betekent inspiratie putten uit het verleden.

In januari 2020, Andrey Kovalevsky en Daniel Kneller, onderzoekers van het Oak Ridge National Laboratory (ORNL) van het Department of Energy (DOE), maakten zich klaar om neutronen te gebruiken om de relatie te bestuderen tussen een bepaald hiv-protease - een eiwit-enzym dat het virus in staat stelt zichzelf te repliceren in het menselijk lichaam - en een klasse van antiretrovirale geneesmiddelen die bekend staat als hiv-proteaseremmers. Sommige soorten hiv bouwen resistentie op tegen deze medicijnen. Het doel van de onderzoekers was om een ​​beter begrip te krijgen van hoe proteasevariaties werken, om de ontwikkeling van geavanceerde behandelingen te ondersteunen om zelfs de meest resistente hiv-stammen te overmeesteren.

Toen het team aan hun werk begon, weinig wisten ze dat, toevallig, hun inspanningen om hiv te bestuderen zouden hen snel op een nieuw pad zetten om COVID-19 aan te pakken, de pandemie die de wereld nu in zijn greep heeft.

Zoals het blijkt, de protease-enzymatische activiteit die HIV in staat stelt te reproduceren - het mechanisme dat Kovalevsky's team zich voorbereidde om te onderzoeken met neutronen - is hetzelfde replicatiemechanisme dat wordt gebruikt door SARS-CoV-2, het virus dat de ziekte COVID-19 veroorzaakt.

Nutsvoorzieningen, het team heeft de focus verlegd van de experimentele benadering die ze wilden gebruiken om hiv te bestuderen om de nieuwe wereldwijde dreiging te bestrijden.

HIV-onderzoeken draaien om nieuw coronavirus

Kovalevsky bestudeert al 15 jaar hiv. Als neutronenkristallograaf, hij bestudeert kleine gekristalliseerde monsters van biologisch materiaal door ze te bombarderen met neutronen. De neutronenverstrooiingstechniek is zeer effectief in het onthullen hoe de atomaire structuur van een monster is gerangschikt en hoe de atomen zich gedragen. Afhankelijk van het doel, Opgedane inzichten kunnen een leidraad bieden voor het verbeteren of zelfs onderdrukken van bepaalde eigenschappen van een biologisch materiaal.

Neutronen zijn een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van biologische structuren en gedragingen vanwege hun acute gevoeligheid voor lichte elementen zoals waterstof en hun vermogen om dergelijke materialen te onderzoeken zonder ze te beschadigen.

in 2019, Kovalevsky begon hiv te bestuderen op een manier die nog nooit eerder was gedaan. Door inelastische neutronenverstrooiing te gebruiken, zou hij gegevens kunnen verzamelen over de dynamiek, of de bewegingen, van een HIV-protease, wat zou bijdragen aan de neutronendiffractiegegevens die hij al jaren verzamelde. Het hebben van zowel structurele als gedrags- of dynamische informatie zou een completer beeld geven van hoe het virus werkt en, beurtelings, zou kunnen leiden tot nieuwe ontwikkelingen in behandelingen.

Na het gebruik van de VISION-spectrometer bij ORNL's Spallation Neutron Source (SNS) - een neutronenverstrooiingsinstrument dat de bewegingen van atomen onthult op basis van hun trillingen - realiseerde Kovalevsky zich dat hij hulp nodig had bij het analyseren van de gegevens.

"Daniel brengt expertise in op het gebied van onderzoek naar virale protease, " legde Kovalevsky uit over het werven van Kneller. "Hij weet hoe hij met de eiwitten in het laboratorium moet werken. Hij kent alle laboratoriumtechnieken op het gebied van eiwitproductie, zuivering, kristallisatie, kristallografische gegevensverzameling, en analyse om inzicht te krijgen in het ontwerp van geneesmiddelen."

Het duurde ongeveer 8 maanden om Daniel in dienst te nemen na een uitgebreide zoektocht, zegt Kovalevsky. Kneller - die gespecialiseerd is in het bestuderen van hiv-protease met behulp van kristallografie - voegde zich in januari 2020 bij het team van Kovalevsky om te helpen met het experimentele en computationele werk aan de hiv-protease.

Maar net toen het team klaar was om erin te duiken, COVID-19 was wereldwijd gegaan, en het onderzoek kwam hard tot stilstand.

Schakelen, vroege resultaten krijgen

In maart, medewerkers van ORNL's Neutronenwetenschappen hebben een plan ontwikkeld om de belangrijkste componenten van COVID-19 te bestuderen door onderzoeksteams samen te stellen en de werkschema's van essentiële instrumenten opnieuw te prioriteren in de twee neutronenverstrooiingsfaciliteiten bij ORNL, SNS en de Hoge Flux Isotoop Reactor (HFIR).

Nadat we de basis hebben gelegd om protease te bestuderen, Kovalevsky en Kneller schakelden prompt over van hiv naar het nieuwe coronavirus. specifiek, ze zijn momenteel gericht op de belangrijkste protease van SARS-CoV-2, het virus dat de ziekte COVID-19 veroorzaakt.

"De SARS-CoV-2-protease is een enzym dat eiwitten snijdt die het virus in staat stellen om zich voort te planten. Begrijpen hoe de protease wordt geassembleerd en hoe het functioneert, is een cruciale eerste stap naar het vinden van effectieve medicijnremmers om het replicatiemechanisme van het virus te blokkeren, " zei Kovalevsky. "Vergelijkbaar met de HIV-protease, de belangrijkste protease van het SARS-CoV-2-virus is momenteel een van de meest aantrekkelijke doelwitten voor geneesmiddelen voor het ontwerpen van specifieke remmers."

Net als bij het oorspronkelijke plan van het hiv-werk, het team bereidt zich voor om instrumenten bij SNS en HFIR te gebruiken om fundamentele inzichten te krijgen in hoe de atomen in de protease zijn gerangschikt. Met behulp van de instrumenten MaNDi en IMAGINE, de onderzoekers zullen de atomaire structuur van het protease kunnen samenstellen door neutronen te gebruiken om de waterstofatomen in de gekristalliseerde eiwitmonsters te volgen.

Maar eerst, ze moeten kristallen van hoge kwaliteit verkrijgen die groot genoeg zijn voor neutronenexperimenten. Hier heeft het team al vroeg grote stappen gezet.

Kristalkwaliteit wordt eerst bepaald door hoe goed ze buigen, of verstrooien, Röntgenstralen. Typisch, dit proces wordt uitgevoerd in een synchrotron-faciliteit, waar de kristallen kunnen worden bevroren tot ongeveer 100 K (of ongeveer -280 ° F).

Het team gebruikte het Protein Crystallization and Characterization-lab bij SNS om SARS-CoV-2-proteasekristallen te kweken, wat ongeveer een week tot 10 dagen duurde. Om de kwaliteit van de kristallen te analyseren, ze gebruikten het lokale röntgenapparaat, een Rigaku HighFlux HomeLab, die een aantal belangrijke bevindingen opleverde.

Eerst, de röntgenexperimenten bevestigden dat de kristallen van hoge kwaliteit waren en dat de methode die werd gebruikt om ze te laten groeien grotere kristallen zou kunnen produceren die geschikt zijn voor neutronenexperimenten. Tweede, met een lokale machine konden ze röntgenmetingen bij kamertemperatuur verzamelen, rond 70°F.

Dankzij de metingen bij kamertemperatuur konden ze de plasticiteit waarnemen, of flexibiliteit, van de proteasestructuur, het verstrekken van waarneembare informatie over hoe de structuur zich gedraagt ​​in omstandigheden die dicht bij de fysiologische omgeving van het virus liggen. Die gegevens konden niet worden verkregen met behulp van bevroren monsters.

"Dit is een belangrijke mijlpaal in onze inspanningen om neutronendiffractie uit te voeren. De investering in een lokaal röntgenapparaat heeft zijn vruchten afgeworpen, zei Kneller. In één geval, we groeiden op maandag kristallen en verzamelden er dinsdag gegevens over. Anders, om die informatie te verkrijgen, zou je je kristallen naar een synchrotron moeten sturen, wat dagen tot weken kan duren."

"En nu, vanwege de pandemie, je kunt niet naar een synchrotron gaan, " voegde Kovalevsky eraan toe. "En om kristallen bij kamertemperatuur te analyseren, je moet er zijn."

"De informatie die we hebben geleerd van de structuur bij kamertemperatuur heeft het vermogen om onmiddellijk invloed te hebben op de computationele richtingen die onderzoekers gebruiken. We hebben enkele verschillen gevonden tussen onze bijna-fysiologische structuur bij kamertemperatuur en de bevroren structuren van de synchrotrons, die van belang kunnen zijn voor het rekenwerk, zoals de docking-onderzoeken met kleine moleculen die worden uitgevoerd op ORNL's supercomputer Summit, ’ zei Kneller.

"Tot dusver, we zijn zeer succesvol geweest in onze vroege onderzoeken naar COVID-19. We hebben al een manuscript ingediend voor publicatie over onze structurele bevindingen, waarin we in wezen twee maanden onderzoek hebben gedaan dat normaal een jaar zou kunnen duren."

Het helpen van Kovalevsky en Kneller bij de gegevens- en structuuranalyse van de eiwitkristallen was Leighton Coates, een instrumentwetenschapper op de SNS MaNDi-diffractometer die ook lid is van het kristallografische team dat het SARS-CoV-2-protease bestudeert.

De gegevens die de komende maanden worden gegenereerd, zullen worden gedeeld met andere nationale laboratoria, universiteiten, en de bredere wetenschappelijke gemeenschap om nauwkeurigere modellen te bouwen voor computersimulaties die worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te identificeren om het virus te stoppen.

"De wetenschappelijke gemeenschap heeft snel gereageerd op de COVID-19-pandemie. We hebben het geluk dat we onze eigen bijdrage kunnen leveren door gebruik te maken van jarenlange ervaring met het bestuderen van hiv om een ​​beter begrip te krijgen van hoe het nieuwe coronavirus zich vermenigvuldigt en hoe we het kunnen bestrijden door het remmen van zijn essentiële protease, ' zei Kovalevsky.

Onderzoek naar hiv-resistentie

Voordat de pandemie hun aandacht en inspanningen richtte op onderzoek naar SARS-CoV-2, Kovalevsky en Kneller hadden een duidelijk plan om hiv aan te vallen.

Negenendertig miljoen mensen over de hele wereld zijn besmet met hiv. Deze mensen betere behandelingsopties bieden, zou niet alleen hun kwaliteit van leven verbeteren, maar ook voorkomen dat deze ziekte zich verder verspreidt.

De HIV-protease werkt door onschadelijke, of niet-functioneel, strengen van eiwitten in kleinere eiwitten, ze veranderen in functionele virale eiwitten die het virus in staat stellen om gezonde menselijke cellen te verzamelen en te blijven infecteren. In het algemeen, HIV-proteaseremmers zijn behoorlijk effectief in het blokkeren van protease tijdens HIV-replicatie, maar sommige variaties van protease hebben een vermogen ontwikkeld om weerstand te bieden aan geneesmiddelremmers.

"Als we meer kunnen leren over de moleculaire mechanismen die HIV-proteasevarianten geneesmiddelresistent maken, we kunnen medicijnen ontwerpen die beter zijn toegerust om zijn verdediging te slim af te zijn, ’ zei Kneller.

specifiek, Kneller en Kovalevsky wilden PRS-17 verkennen, een unieke HIV-proteasevariant die 10 is, 000 keer minder kans dan andere niet-resistente varianten om te worden geremd door de meest effectieve klinische HIV-proteaseremmers die momenteel beschikbaar zijn. Kovalevsky legde uit dat hoewel hiv-behandelingsprogramma's een lange weg hebben afgelegd sinds de hiv-pandemie voor het eerst begon in de jaren tachtig, mutante varianten zoals PRS-17, als gevolg van langdurige behandeling, jaren van farmaceutische innovatie en vooruitgang in gevaar zou kunnen brengen en zou kunnen leiden tot mislukte antivirale therapieën.

"Drugresistentie is nu het grootste probleem voor hiv-patiënten. Met de juiste behandeling, patiënten kunnen een lang en gelukkig leven leiden met niet-detecteerbare niveaus van hiv in hun systeem. Ze zullen geen aids krijgen of hiv naar anderen verspreiden. Maar PRS-17 en andere resistente HIV-proteasevarianten maken het voor artsen moeilijk om HIV bij hun patiënten te bestrijden, ' zei Kovalevsky.

Het is moeilijk om precies te begrijpen hoe PRS-17 de werkzaamheid van HIV-proteaseremmers neutraliseert, zeggen de onderzoekers. De samenstellende eiwitten van virussen zijn complexe systemen, en PRS-17 kan verschillende mechanismen gebruiken om zichzelf te beschermen tegen antiretrovirale geneesmiddelen.

"Uitzoeken hoe PRS-17 bestand is tegen HIV-proteaseremmers is een uitdaging, maar een die we absoluut moeten overwinnen. PRS-17 is een klinisch isolaat, wat betekent dat het afkomstig is van een echte patiënt die worstelt om deze ziekte te bestrijden, ", legt Kneller uit. "Meer informatie erover kan het leven van veel patiënten redden, omdat de kennis die we opdoen met behulp van neutronen op PRS-17 overdraagbaar zal zijn naar andere vergelijkbare, extreem resistente proteasevarianten."

Het team was van plan een kaart van het PRS-17-protease te maken om de moleculaire mechanismen achter de resistentie tegen geneesmiddelen beter te begrijpen. Dat betrof het gebruik van de instrumenten MaNDi en VISION bij SNS en het IMAGINE-instrument bij HFIR.

"Het was ongeveer dezelfde aanpak die we nu proberen met COVID-19, ' zei Kovalevsky.

Met MaNDi en IMAGINE, Kneller en Kovalevsky waren van plan om gekristalliseerde monsters van PRS-17-protease te onderzoeken om gedetailleerde gegevens over de statische atomaire structuur te genereren. Door VISION te gebruiken, zouden ze poedervormige monsters van PRS-17-protease kunnen onderzoeken om inzicht te krijgen in de dynamische eigenschappen ervan door de moleculaire trillingen te meten.

Neutronen zijn bijzonder geschikt om componenten van virussen zoals HIV (of SARS-CoV-2) te bestuderen vanwege hun gevoeligheid voor waterstof, een belangrijk onderdeel van alle eiwitten. Met neutronenkristallografie, het team kon elk waterstofatoom precies lokaliseren in het protease van PRS-17, waardoor ze ongekend inzicht krijgen in hoe het eiwit functioneert en welke interacties het ondergaat met een proteaseremmer.

"Gebruik neutronenkristallografie bij MaNDi en IMAGINE om waterstofatomen te lokaliseren in kristallen van PRS-17-protease, ons in staat zou stellen een uitgebreid profiel van zijn statische structuur op te bouwen, "zei Kneller. "Met VISIE, we zouden ook waterstofatomen volgen, maar we zouden poedervormige monsters van PRS-17-protease gebruiken die opnieuw zijn gehydrateerd om de overvolle omstandigheden van een HIV-viraal deeltje na te bootsen. Dat zou ons in staat stellen om zijn dynamische eigenschappen te zien en meer te leren over hoe het zou kunnen bewegen wanneer het in een viraal deeltje werkt."

Kneller legde uit dat het verkrijgen van informatie over zowel de statische als dynamische eigenschappen van PRS-17 belangrijk is voor het ontwikkelen van een volledig begrip van de resistentie van dit virus tegen antiretrovirale geneesmiddelen.

"Als ik je locatie maar één keer per dag om middernacht zou volgen, Ik zou denken dat je al je tijd thuis doorbrengt. Maar echt, je beweegt nogal wat gedurende de dag. Daarom is het belangrijk om zowel statische als dynamische metingen van ons monster te verzamelen. Het laat ons een vollediger beeld krijgen van het gedrag van protease, ’ zei Kneller.

"Zonder neutronenkristallografie, onderzoekers moeten gefundeerde gissingen maken over waar waterstofatomen zich in een eiwit bevinden wanneer ze proberen te begrijpen hoe het eiwit zijn werk doet, " voegde Kneller toe. "Dit soort experimenten dat Andrey eerder heeft gedaan, heeft de locaties van deze waterstofatomen in niet-resistente HIV-proteasevarianten kunnen bevestigen, maar nooit in een extreem resistente proteasevariant. Dat betekent dat we werkelijk unieke en nieuwe gegevens over deze protease zouden kunnen produceren."

Kneller en Kovalevsky hopen op een dag door middel van hun experimenten gegevens te genereren die van onschatbare waarde zullen zijn voor onderzoekers die de resistente hiv-stammen willen bestrijden.

"Het is een teamprestatie. Chemici, biologen, en professionals uit de farmaceutische industrie moeten samenwerken om ziekten te bestrijden, "zei Kneller. "Samen, we kunnen effectieve behandelingen ontwikkelen voor resistente hiv-stammen."

Onderzoek werd ondersteund door het DOE Office of Science via het National Virtual Biotechnology Laboratory, een consortium van nationale DOE-laboratoria gericht op reactie op COVID-19, met financiering door de Coronavirus CARES Act.