Eiwit-nanomachines gemaakt van meerdere eiwitmoleculen zijn zeer dynamisch tijdens hun acties op hun functionele doelen, soms substraten genoemd. De dynamiek van deze grote eiwitnanomachines met een molecuulgewicht van meer dan megadalton is ongevoelig voor structurele analyse door bestaande technologie zoals röntgenkristallografie en kernmagnetische resonantiespectroscopie. Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), een opkomende technologie voor structuurbepaling met hoge resolutie, heeft het potentieel om de dynamiek van grote eiwitnanomachines te visualiseren, maar de bestaande cryo-EM-reconstructies van zeer dynamische structuren zijn beperkt tot matige tot lage resolutie.

Wetenschappers hebben er lang van gedroomd om de dynamiek van grote moleculaire machines van megadalton-afmetingen in atomaire details te decoderen, de uiteindelijke determinant van hun biologische functies. Nutsvoorzieningen, een team van biofysici van de Universiteit van Peking, Dana-Farber Cancer Institute en Harvard Medical School hebben cryo-EM gebruikt om de dynamiek op atomair niveau van het 2,5-megadalton proteasoom te visualiseren, de grootste bekende eiwitafbrekende machine in eukaryote cellen, tijdens zijn chemo-mechanische werking op een eiwitsubstraat. Ze reconstrueerden een bijna volledige dynamische procedure van substraatverwerking in het menselijke proteasoom met een ongekende resolutie die de bepaling van atomaire details in 3D mogelijk maakte, vergelijkbaar met het filmen van een 3D-film, atoom voor atoom.

"Dit werk maakt de weg vrij om de thermodynamica van megadalton-nanomachines te bestuderen met atomaire precisie ver weg van evenwicht, " zei Youdong Mao, een biofysicus en corresponderend auteur van een nieuw baanbrekend artikel gepubliceerd in het eerste nummer van het tijdschrift Natuur in 2019. "Deze studie opent tal van mogelijkheden voor op structuren gebaseerde ontdekking van geneesmiddelen gericht op menselijk proteasoom voor de behandeling van multipel myeloom en neurodegeneratieve ziekten."

Het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS) is de belangrijkste eiwitafbraakroute in cellen. Het handhaaft de balans van eiwitmaterialen in levende cellen, en speelt een cruciale rol bij snelle afbraak van regulerende eiwitten, verkeerd gevouwen eiwitten of beschadigde eiwitten. UPS is betrokken bij aantoonbaar alle cellulaire processen, zoals de celcyclus, genexpressieregulatie enzovoort. Abnormaal eiwitmetabolisme veroorzaakt door UPS-stoornis is direct gerelateerd aan veel menselijke ziekten, waaronder kanker. In 2004, Aaron Ciechanover, Irwin Rose en Avram Hershko kregen de Nobelprijs voor scheikunde voor hun ontdekking van deze afbraakroute. De kern van de UPS is het proteasoom dat verantwoordelijk is voor de afbraak van ubiquitine-gelabelde substraten. Het is een van de meest fundamentele en gecompliceerde gigantische holoenzymmachines in cellen. Menselijk proteasoom holoenzym bevat ten minste 33 verschillende subeenheidtypes met een totaal molecuulgewicht van ongeveer 2,5 megadalton. Het is ook bekend als het directe doelwit van verschillende geneesmiddelen met kleine moleculen die zijn goedgekeurd door de FDA van de Verenigde Staten voor de behandeling van multipel myeloom.

Door gebruik te maken van cryo-EM in combinatie met machine learning-technologie, het team bepaalde dynamische structuren van het substraat-geënte menselijke proteasoom in zeven tussenliggende conformatietoestanden met een resolutie van 2,8-3,6 , gevangen tijdens de afbraak van een gepolyubiquityleerd eiwit. Bij deze resolutie het team was in staat om enkele magnesiumionen te identificeren die aan zowel ATP als ADP waren gebonden in de cryo-EM-dichtheidskaarten. Deze 3D-structuren verlichten een opmerkelijk spatiotemporeel continuüm van dynamische substraat-proteasoominteracties.

Intrigerend, het team ontdekte dat de initiatie van substraattranslocatie uitgebreid wordt gecoördineerd met andere dynamische regulerende gebeurtenissen die het proteasoom voorbereiden op processieve substraatafbraak. Door verdere systematische analyse, het team ontdekte hoe de chemische energie van ATP-hydrolyse wordt omgezet in het mechanische werk van het ontvouwen van het substraat via een zeer gecoördineerd proces van conformatieveranderingen van meerdere eiwitten.

Hun bevinding biedt nieuwe inzichten in de volledige cyclus van substraatverwerking en suggereert verschillende modi gevolgd door ATP-hydrolyse in het proteasoomholo-enzym. Er wordt aangenomen dat dit de eerste keer is dat een volledige cyclus van sequentiële ATP-hydrolyse in een AAA-ATPase heterohexamere motor op atomair niveau werd gevisualiseerd. Dit lost een al lang bestaand wetenschappelijk debat over ATPase-hexameren tussen twee veronderstelde modellen op, één suggereert opeenvolgende ATP-hydrolyse en de andere veronderstelt willekeurige hydrolytische gebeurtenissen in de hexamere ring. Opmerkelijk, het team observeerde drie hoofdmodi van sterk gecoördineerde ATP-hydrolyse, met hydrolytische gebeurtenissen in twee tegenover elkaar liggende ATPasen, in twee aangrenzende ATPasen, en in één ATPase tegelijk. Deze hydrolytische modi reguleren op elegante wijze deubiquitylering, translocatie initiatie, en procesmatig ontvouwen van substraten, respectievelijk.

Het team merkte bepaalde beperkingen op in deze studie, inclusief dat de veelheid aan nucleotideverwerkingsgebeurtenissen in verschillende ATPasen tijdens overgangen tussen opeenvolgende toestanden van het proteasoom mogelijk hebben geleid tot de afwezigheid van snelle stappen en dunbevolkte tussenliggende toestanden in hun cryo-EM-reconstructies. Het team voorziet het vooruitzicht van verdere verkenningen in dit opzicht door deze ontbrekende tussenpersonen te identificeren om te verduidelijken hoe ATP-hydrolytische gebeurtenissen en nucleotide-uitwisseling met elkaar worden gecoördineerd, en allosterisch gekoppeld aan substraattranslocatie. "Verdere ontwikkeling in data-analysetechnologie is nodig om nog meer dynamische informatie uit dezelfde dataset te halen, "Zei Mao. "Er is nog een lange weg te gaan voor datagestuurde machine learning-technologie om de potentiële kracht van cryo-EM volledig te ontketenen bij het oplossen van de complexe dynamiek van megadalton-moleculaire machines."