Onderzoekers van het Instituut voor Fysische Chemie van de Poolse Academie van Wetenschappen hebben aangetoond, met behulp van een superresolutie microscopische techniek, hoe chemische reacties te volgen die plaatsvinden in zeer kleine volumes. De methode is ontwikkeld in samenwerking met PicoQuant GmbH, en maakt het mogelijk om reacties binnen individuele cellulaire organellen zoals celkernen waar te nemen.

De chemische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de vitale functies van de cel, verbergen nog steeds veel geheimen - pas onlangs hadden onderzoekers de tools om rechtstreeks te kijken naar de chemische verschijnselen die zich in levende cellen voordoen. Echter, wegens aanhoudende technische beperkingen, de wetenschap mist basiskennis over de evenwichtsconstante waarden van chemische reacties in cellen. Met andere woorden, onderzoekers weten nog steeds niet hoeveel van een chemische stof die betrokken is bij een bepaalde cellulaire reactie zich in een reeds gereageerde vorm bevindt en hoeveel in een niet-gereageerde vorm. Deze uitdagingen zijn in de huidige studie overwonnen. Het onderzoeksteam heeft een wijziging van superresolutie-fluorescentiecorrelatiespectroscopie ontwikkeld en gedemonstreerd.

“We hebben al heel lang te maken met chemische reacties in cellen. in 2013, we hebben de diffusiecoëfficiënten bepaald van alle eiwitten in de Escherichia coli-bacterie, waardoor het mogelijk werd om de snelheid van reacties te bepalen die plaatsvonden met hun deelname. Hier waren we geïnteresseerd in een soortgelijk probleem in situaties met lage concentraties reagentia, " zegt Prof. Robert Holyst (IPC PAS). "Biologische reacties zijn over het algemeen omkeerbaar en, waar ze voorkomen, er ontstaat meestal een bepaald dynamisch evenwicht tussen de hoeveelheid gereageerde en niet gereageerde stoffen. In onze pogingen om de evenwichtsconstanten voor verschillende reacties in cellen te bepalen, we keken naar superresolutie fluorescentiecorrelatiespectroscopie. En hier, we kwamen een interessant technisch probleem tegen waarvan de oplossing nieuwe mogelijkheden voor ons opende in de studie van de chemie van het leven."

Er zijn veel soorten microscopie, inclusief die welke individuele atomen visualiseren. Echter, bij het observeren van cellen, optische microscopie blijft onverslaanbaar vanwege de lage invasiviteit en het vermogen om de ruimtelijke structuur van levende organismen te visualiseren. Voor een lange tijd, het fundamentele nadeel was de relatief slechte resolutie - fundamentele fysieke beperkingen (diffractie) maken het onmogelijk om details kleiner dan ongeveer 200 nanometer te onderscheiden met standaard optische technieken.

Een type optische microscopie is fluorescentiemicroscopie. Het omvat het introduceren van een fluorescerende kleurstof in de plaatsen van het biologische monster dat wordt bestudeerd, en vervolgens het monster scannen met een gerichte laserstraal, die de kleurstofmoleculen stimuleert om te gloeien. 1994, Stefan W. Hell presenteerde een methode om de diffractielimiet in fluorescentiemicroscopie te overschrijden door middel van gestimuleerde emissiedepletie (STED). STED vereist een extra laserstraal die in doorsnede lijkt op een donut. Deze straal dooft de externe gebieden van het hoofdfocus van de laserstraal en verkleint dientengevolge de grootte tot waarden onder de diffractielimiet. Met superresolutiemethoden is het nu mogelijk om ruimtelijke details van slechts 10 nm te zien met een tijdresolutie tot microseconden.

Fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) is een nieuwe tak van optische microscopie voor het bestuderen van de beweging van moleculen. In superresolutievarianten, het brandpunt van de laser heeft een volume gemeten in tientallen attoliters (een attoliter is een miljardste van een miljardste van een liter). De meting omvat het meten van het licht dat wordt uitgezonden door een fluorescerende kleurstof die is bevestigd aan het geteste molecuul dat wordt geëxciteerd door een laserstraal. De grootte van de focus en de duur van de fluorescentie kennen, en met behulp van de juiste theoretische modellen, het is mogelijk om de snelheid van zelfs individuele moleculen te bepalen.

"Al enige tijd, het is bekend dat, hoewel FCS-microscopie met superresolutie goed werkt bij het observeren van moleculen die in twee dimensies bewegen, bijv. in lipidemembranen, het faalt in waarnemingen in volumes. Diffusietijden, bepaald op basis van metingen in 3D, een orde van grootte of zelfs meer kunnen verschillen van de voorspellingen van metingen in 2D. Na een paar maanden onderzoek, het werd ons duidelijk dat deze discrepanties te wijten waren aan de overdreven vereenvoudigde manier om de ruimtelijke grootte van de focus te bepalen, " zegt Dr. Krzysztof Sozanski (IPC PAS).

Op basis van hun eigen theoretische analyses en ervaringen, de onderzoekers van Warschau bouwden een nieuwe, universeel theoretisch model dat een correctie introduceert van de ruimtelijke vorm van de focus en rekening houdt met de impact ervan op de gemeten signaal-ruisverhouding. De juistheid van het model werd aanvankelijk geverifieerd in metingen van de diffusiesnelheid van verschillende fluorescerende sondes in oplossingen.

“We hebben ook meer geavanceerde experimenten gedaan. we bestudeerden een omkeerbare reactie waarbij de kleurstofmoleculen zich hechten aan micellen en na enige tijd weer loslaten. Het systeem, samengesteld uit relatief grote ballen van oppervlakteactieve moleculen die reageren met de kleurstofmoleculen, weerspiegelde omstandigheden die kenmerkend zijn voor biologische structuren, ", zegt promovendus Xuzhu Zhang (IPC PAS). De metingen waren niet eenvoudig. Als de moleculen van beide reactanten langzaam zouden bewegen, bij het passeren van de focus zou de kleurstof herhaaldelijk kunnen fuseren/loskoppelen met/van de micellen en het uitgestraalde licht zou worden gemiddeld.

Maar er zou ook een variant van het andere uiterste kunnen zijn:de verbindings- en ontkoppelingsreacties zouden zo langzaam kunnen verlopen dat tijdens de overgang door de focus er geen verandering zou optreden in de relatie tussen de reagentia - dan zou er geen middeling zijn. "Ons model houdt niet alleen rekening met beide extreme gevallen, maar ook alle tussenliggende. En met de kennis die we tot onze beschikking hebben over de werkelijke grootte van de focus, we zijn in staat om de grootte te veranderen en experimenteel alle gevallen te onderzoeken die het model nodig heeft, zowel in hetzelfde chemische systeem als op dezelfde apparatuur, " benadrukt Zhang.

Een belangrijk kenmerk van de door de IPC PAS ontwikkelde analysemethode is dat er voor de toepassing ervan geen apparaatwijzigingen nodig zijn. Na de juiste aanpassing, de methode kan worden gebruikt om gegevens die zijn vastgelegd door FCS-ready STED-microscopen die al in productie zijn, nauwkeuriger te interpreteren.