Door John Brennan
Bijgewerkt op 24 maart 2022

Gelelektroforese blijft het werkpaard van laboratoria voor moleculaire biologie. Door een elektrisch veld aan te leggen worden DNA en eiwitten gescheiden – meestal op grootte – in een gelmatrix. Hoewel de techniek gebruikelijk is, varieert de manier waarop de resultaten worden geïnterpreteerd afhankelijk van de downstream-toepassing, of het nu een Western-blot, Northern-blot, Southern-blot of een eenvoudige agarose-run is.

Wanneer u met agarosegels werkt, domineren twee taken:1) het onderscheiden van ongesneden, gekerfde en lineaire plasmiden van uw insert, en 2) het schatten van de fragmentgroottes met behulp van een betrouwbare standaardcurve. De volgende stappen begeleiden u op een duidelijke, reproduceerbare manier door dat proces.

Stap 1 – Identificeer uw rijstroken

Raadpleeg uw laboratoriumnotitieboekje om te bevestigen welk monster in elke baan is geladen. De baanlabels die u bij het laden heeft genoteerd, vormen uw uitgangspunt voor alle daaropvolgende berekeningen.

Stap 2 – Zoek de DNA-ladder

De ladder bevat fragmenten van bekende lengte. De migratieafstanden zullen dienen als referentie voor het dimensioneren van uw onbekende banden.

Stap 3 – Meet de trackingkleurstof

Meet met behulp van een liniaal de afstand van de put tot de trackingkleurstof (de kleurstof die het verst reist). Noteer deze waarde; de eenheden zijn willekeurig zolang ze consistent zijn.

Stap 4 – Bepaal de relatieve mobiliteit

Meet de afstand van elke ladderband tot de put en deel deze vervolgens door de tracking-kleurstofafstand. Dit levert voor elke standaard de relatieve mobiliteit (mobiliteitsfactor) op.

Voorbeeld:als de trackingkleurstof 15 cm aflegde en de ladderbanden 5, 4,5 en 3,5 cm, zijn de relatieve mobiliteiten 0,833, 0,75 en 0,583.

Stap 5 – Registreer mobiliteit en omvang

Voer de relatieve mobiliteiten en bijbehorende fragmentgroottes (in kilobases) in een spreadsheet in. Fabrikanten vermelden deze maten doorgaans in het gegevensblad van de ladder.

Stap 6 – Teken de gegevens

Maak een grafiek met relatieve mobiliteit op de X-as en fragmentgrootte op de Y-as.

Stap 7 – Pas een standaardcurve aan

Gebruik de trendlijnfunctie om een machtswetvergelijking te fitten (bijvoorbeeld y =ax^‑2). Streef naar een R² van minimaal 0,90 om een betrouwbare curve te garanderen.

Stap 8 – Inspecteer de monsterbanden

Kleinere fragmenten migreren verder. Merk op dat supercoiled (ongesneden) plasmiden verder reizen dan lineaire fragmenten van dezelfde grootte, terwijl gekerfde plasmiden langzamer migreren.

Stap 9 – Banden aan samples koppelen

Vergelijk de banden van elke baan met het monster dat u hebt geladen. Voor een plasmide dat is gedigereerd met twee enzymen, zou je twee verschillende banden moeten zien:één aan de bovenkant (insert) en één aan de onderkant (geknipte plasmide). Een digest met één enzym zou een enkele band moeten produceren die iets verder reist dan het ongesneden plasmide, maar veel minder dan het insert.

Stap 10 – Bereken de relatieve mobiliteit van onbekenden

Meet de afstand van de put tot elke onbekende band, deel deze door de tracking-dye-afstand en verkrijg de relatieve mobiliteit.

Stap 11 – Schat de fragmentgrootte

Voer de relatieve mobiliteiten in de vergelijking afgeleid in stap 7 in om de geschatte grootte van elk fragment te berekenen.

Dingen die nodig zijn

• Gegelbeeld met hoge resolutie vastgelegd onder UV-verlichting
• Spreadsheetsoftware (Excel, Google Spreadsheets, enz.)
• Liniaal of schuifmaat voor nauwkeurige afstandsmeting

TL;DR

Als u brede, heldere banden aan de onderkant van elke baan waarneemt, heeft u waarschijnlijk RNA-besmetting. Controleer uw zuiveringsstappen.