Door Andy Pasquesi | Bijgewerkt op 24 maart 2022

CMB/Moment/GettyImages

Gelelektroforese is een hoeksteentechniek in de moleculaire biologie die DNA-fragmenten op grootte scheidt en deze voor analyse openbaar maakt. Door DNA-monsters in te bedden in een agarosegelmatrix en een elektrisch veld aan te leggen, migreren de negatief geladen strengen naar de anode, waarbij kortere fragmenten sneller reizen dan langere.

Visualisatie met ethidiumbromide

Ethidiumbromide (EtBr) wordt in het agarosemengsel (agarosepoeder, EDTA-buffer, water) opgenomen. Zodra de gel polymeriseert, wordt EtBr gelijkmatig door de matrix verdeeld. Nadat DNA-monsters en trackingkleurstoffen in de putjes zijn geladen, wordt de gel onderworpen aan een gecontroleerde spanning die het DNA door de poriën trekt.

Terwijl de strengen bewegen, intercaleert EtBr tussen basenparen, bindt tijdelijk aan het DNA en draagt het fluorescentiesignaal mee. Aan het einde van de run heeft elk fragment een aanzienlijke hoeveelheid EtBr geabsorbeerd. Door de gel te belichten met een UV-transilluminator wordt de gebonden kleurstof opgewonden, waardoor de DNA-banden gaan gloeien. Een gekalibreerde camera legt het beeld vast voor documentatie.

Alternatieve kleuring met methyleenblauw

Wanneer er geen UV-transilluminator beschikbaar is, kan de gel worden gekleurd met methyleenblauw. Na elektroforese zorgt het weken van de gel gedurende een nacht in een methyleenblauwoplossing ervoor dat de kleurstof de matrix kan binnendringen en via waterstofbinding aan het DNA kan binden. De resulterende blauwe kleur is met het blote oog zichtbaar en biedt een eenvoudig, goedkoop alternatief voor fluorescentie.

Kleurstoffen volgen voor schatting van de grootte

Trackingkleurstoffen, zoals broomfenolblauw en xyleencyanol, worden aan de laadbuffer toegevoegd om de voortgang te volgen zonder de DNA-migratie te verstoren. Broomfenolblauw beweegt met een snelheid die overeenkomt met ~300 nucleotiden, terwijl xyleencyanol overeenkomt met ~4.000 nucleotiden. Door de positie van een DNA-band te vergelijken met deze markers, kunnen technici de fragmentgrootte in basenparen schatten.

Samenvattend maakt gelelektroforese in combinatie met de juiste kleur- en trackingkleurstoffen een nauwkeurige visualisatie en dimensionering van DNA-fragmenten mogelijk, wat de basis vormt van talloze genetische analyses.