Thinkstock Images/Comstock/Getty Images

In de begindagen van de genetische manipulatie leek het idee om eigenschappen van het ene organisme op het andere te enten vergezocht. Tegenwoordig is het inbrengen van vreemd DNA in een gastheergenoom echter een routineproces, of het nu gaat om het toevoegen van plaagresistente genen aan maïs, het tot expressie brengen van menselijke insuline in bacteriën, of het modelleren van menselijke kankers bij muizen. Hoewel de technische details ingewikkeld kunnen zijn, blijft de overkoepelende reeks stappen consistent en logisch.

Stap 1

Begin met het behandelen van het plasmide-DNA en het vreemde DNA-fragment met een gekozen restrictie-enzym. Deze enzymen herkennen specifieke basismotieven en maken nauwkeurige sneden, waardoor compatibele uiteinden worden gegenereerd voor stroomafwaartse ligatie. Restrictie-enzymen zijn van nature afkomstig van bacteriële afweersystemen die binnendringend viraal DNA splitsen.

Stap 2

Meng vervolgens de verteerde plasmideskelet met het gesplitste vreemde DNA en voeg DNA-ligase toe. De resulterende complementaire plakkerige uiteinden versmelten en ligase sluit de inkepingen af, waardoor cirkelvormige plasmiden worden geproduceerd die het ingevoegde DNA-segment dragen.

Stap 3

Introduceer de recombinante plasmiden in competente bacteriële cellen en laat ze herstellen. De kolonies die het plasmide hebben opgenomen, zullen groeien op selectieve media die het juiste antibioticum bevatten, dankzij de resistentiemarker die op het plasmide is gecodeerd. Transformatie kan worden bereikt via hitteschok, elektroporatie of chemische competentie, afhankelijk van de bacteriestam.

Stap 4

Oogst cellen uit individuele kolonies, lyseer ze met een wasmiddelbuffer om plasmide-DNA vrij te maken, en denatureer vervolgens de strengen door hitte- of alkalibehandeling. Dit bereidt het DNA voor op verdere screening.

Stap 5

Hybridiseer het geëxtraheerde DNA met een fluorescent gelabelde probe die complementair is aan de ingevoegde sequentie. Stel het monster bloot aan UV-verlichting; regio's met een perfecte match zullen fluorescentie uitzenden, wat de aanwezigheid van het vreemde gen bevestigt.

Stap 6

Selecteer kolonies die positief testten voor de insert, breid ze uit en isoleer het plasmide-DNA. Versterk het plasmide, indien nodig, met PCR om voldoende materiaal te genereren voor verdere analyses of downstream-toepassingen.

Dingen die nodig zijn

• restrictie-enzymen
• plasmide-DNA
• vreemd DNA-fragment (genomisch DNA)
• DNA-ligase
• celkweekmedium
• fluorescerend DNA-fragment van de probe
• polymerasekettingreactiemachine
• natriumhydroxide
• groeimedium