Biologen gebruiken verschillende technieken om celcomponenten te isoleren, afhankelijk van het specifieke organel of molecuul waarin ze geïnteresseerd zijn. Hier zijn enkele van de meest voorkomende methoden:

1. Celverstoring:

* Mechanische methoden:

* Homogenisatie: Met behulp van een blender of een snelle homogenisator om open cellen fysiek te breken.

* Sonicatie: Gebruik van geluidsgolven om celmembranen te verstoren.

* Franse pers: Cellen dwingen door een kleine opening onder hoge druk.

* slijpen: Een mortel en stamper gebruiken om cellen fysiek te breken.

* Chemische methoden:

* wasmiddelen: Celmembranen verstoren door lipiden op te lossen.

* enzymen: Gebruik specifieke enzymen zoals lysozyme om celwanden af te breken.

* osmotische schok: Het veranderen van de osmotische druk van de oplossing om celmembranen te verstoren.

2. Differentiële centrifugatie:

* Na celverstoring wordt het cellysaat gesponnen bij toenemende snelheden en duur. Dit scheidt componenten op basis van hun grootte en dichtheid.

* Centrifugatie met lage snelheid: Pellet grotere componenten zoals kernen en celafval.

* middelgrote snelheid centrifugatie: Pellet mitochondria en lysosomen.

* Hoge snelheid centrifugatie: Pelletmicrosomen en ribosomen.

* Ultracentrifugatie: Pellet kleinere componenten zoals eiwitten en nucleïnezuren.

3. Dichtheidsgradiënt Centrifugatie:

* Deze methode verfijnt verder de scheiding die wordt bereikt door differentiële centrifugatie. Een gradiënt van sucrose of andere stoffen wordt gemaakt in een buis en het cellysaat is gelaagd. Tijdens de centrifugatie gaan componenten door de gradiënt totdat ze een dichtheid bereiken die gelijk is aan de hunne.

* typen:

* sucrose gradiënt: Vaak gebruikt voor het scheiden van organellen.

* cesiumchloride gradiënt: Uitstekend voor het isoleren van DNA en RNA.

4. Affinity -chromatografie:

* Deze methode maakt gebruik van de specifieke binding van een doelmolecuul aan een geïmmobiliseerd ligand op een kolom.

* ligand: Een molecuul dat specifiek bindt aan het doelmolecuul.

* kolom: Een solide matrix met het geïmmobiliseerde ligand.

* elutie: Na binding wordt het doelmolecuul uit de kolom geëlueerd met behulp van een specifieke oplossing.

5. Elektroforese:

* Gebruikt om eiwitten te scheiden op basis van grootte en lading, en nucleïnezuren op basis van grootte.

* SDS-PAGE: Scheidt eiwitten op basis van grootte.

* Agarosegelelektroforese: Scheidt nucleïnezuren op basis van grootte.

6. Immunoprecipitatie:

* Deze methode gebruikt antilichamen om specifieke eiwitten te isoleren.

* antilichamen: Binden aan een specifiek eiwit van belang.

* neerslag: Na binding wordt het eiwit-antilichaamcomplex uit de oplossing neergeslagen.

7. Flowcytometrie:

* Deze methode maakt gebruik van lasers en fluorescerende probes om cellen of celcomponenten te analyseren en te sorteren op basis van hun fysieke en biologische kenmerken.

Voorbeeld:Mitochondria isoleren

* Cellen worden verstoord met behulp van homogenisatie of een Franse pers.

* Het cellysaat wordt op een gemiddelde snelheid gecentrifugeerd om mitochondria te pellet.

* De pellet wordt geresuspendeerd en verder gezuiverd met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

De keuze van de methode hangt af van het specifieke celtype, het organel of molecuul van interesse en het gewenste niveau van zuiverheid. Elke techniek heeft zijn sterke en zwakke punten en onderzoekers gebruiken vaak een combinatie van methoden om hun gewenste resultaten te verkrijgen.