Een genomische bibliotheek maken:een stapsgewijze handleiding

Een genomische bibliotheek is een verzameling gekloonde DNA -fragmenten die het hele genoom van een organisme vertegenwoordigen. Het is als een reeks instructies, met alle genetische informatie die nodig is om dat organisme op te bouwen en te behouden. Hier is hoe het wordt geproduceerd:

1. DNA -extractie:

* isoleer genomisch DNA: Dit omvat het breken van open cellen en het extraheren van het DNA met behulp van verschillende technieken zoals enzymatische digestie en zuivering.

2. DNA -fragmentatie:

* Snijd DNA in beheersbare stukken: Genomisch DNA is te groot om direct te worden gekloond. Het moet worden gefragmenteerd in kleinere stukken, meestal 10-20 kb lang, met behulp van restrictie-enzymen. Deze enzymen snijden DNA op specifieke herkenningsplaatsen en produceren fragmenten met gedefinieerde uiteinden.

3. Vectorvoorbereiding:

* Kies een geschikte vector: Een vector is een DNA -molecuul dat werkt als een drager voor de genomische DNA -fragmenten. Gemeenschappelijke vectoren omvatten plasmiden, bacteriofagen en cosmides. Deze vectoren zijn ontworpen om specifieke kenmerken te hebben, zoals antibioticaresistentiegenen en meerdere kloneringsplaatsen (MC's) waar de DNA -fragmenten kunnen worden ingevoegd.

* lineariseer de vector: Het vector -DNA wordt gesneden met een restrictie -enzym dat een plaats binnen de MCS herkent, waardoor een lineair molecuul met plakkerige uiteinden wordt gegenereerd.

4. Ligatie:

* Combineer DNA -fragmenten en vectoren: Het gefragmenteerde genomische DNA en gelineariseerde vectoren worden gemengd met DNA -ligase, een enzym dat DNA -fragmenten verbindt door fosfodiesterbindingen te vormen. Dit creëert recombinante DNA -moleculen, waarbij genomische DNA -fragmenten in de vectoren worden ingebracht.

5. Transformatie:

* Introduceer recombinante moleculen in gastheercellen: De recombinante DNA -moleculen worden geïntroduceerd in geschikte gastheercellen, vaak bacteriën. Deze cellen kunnen efficiënt buitenlandse DNA -moleculen innemen via een proces dat transformatie wordt genoemd.

* Selecteer voor cellen die recombinant DNA bevatten: De gastheercellen worden gekweekt op selectieve media die antibiotica bevatten. Alleen cellen die het recombinante DNA dragen met het antibioticaresistentiegen kunnen groeien, zodat de bibliotheek alleen cellen bevat die de ingevoegde genomische fragmenten dragen.

6. Bibliotheekversterking:

* Kweek de getransformeerde cellen: De cellen die het recombinante DNA bevatten, worden gekweekt en mogen repliceren, waardoor kolonies worden geproduceerd. Elke kolonie vertegenwoordigt een kloon die een enkel genomisch DNA -fragment bevat.

* Bewaar de bibliotheek: De genomische bibliotheek kan op verschillende manieren worden opgeslagen, waaronder bevroren bacteriële culturen of als een verzameling plasmide -DNA.

7. Screening en analyse:

* Identificeer specifieke DNA -fragmenten: Technieken zoals hybridisatie en PCR worden gebruikt om de bibliotheek te screenen op specifieke genen of DNA -sequenties van interesse.

* Analyseer de DNA -fragmenten: Sequencing en andere technieken worden gebruikt om de gekloonde DNA -fragmenten te analyseren, waardoor waardevolle inzichten in het genoom van het organisme worden geboden.

Belangrijkste overwegingen:

* Genoomgrootte: De complexiteit van de bibliotheek hangt af van de grootte van het genoom dat wordt gekloond. Grotere genomen vereisen een groter aantal klonen.

* vectorcapaciteit: De keuze van de vector is afhankelijk van de grootte van de te klonen van de DNA -fragmenten.

* Compatibiliteit van hostcellen: De gastheercel moet in staat zijn om de recombinante DNA -moleculen efficiënt in te nemen en te repliceren.

* Bibliotheekgrootte: Een complete genomische bibliotheek moet voldoende klonen bevatten om het hele genoom met een grote waarschijnlijkheid weer te geven.

De genomische bibliotheek dient als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de organisatie, structuur en functie van genen in een organisme. Het is cruciaal voor verschillende toepassingen in biotechnologie, geneeskunde en landbouw, wat bijdraagt aan vooruitgang op gebieden zoals gentherapie, diagnostiek en verbetering van gewassen.