Wetenschap
Een kleine factor heeft een grote impact op genoombewerking
Door jaren van engineering van systemen voor het bewerken van genen hebben onderzoekers een reeks hulpmiddelen ontwikkeld die de modificatie van genomen in levende cellen mogelijk maken, vergelijkbaar met 'genoomchirurgie'. Deze hulpmiddelen, waaronder hulpmiddelen die zijn gebaseerd op een natuurlijk systeem dat bekend staat als CRISPR/Cas9, bieden een enorm potentieel voor het aanpakken van onvervulde klinische behoeften, onderstreept door de recente goedkeuring door de FDA van de eerste op CRISPR/Cas9 gebaseerde therapie.
Een relatief nieuwe aanpak genaamd "prime editing" maakt het bewerken van genen mogelijk met uitzonderlijke nauwkeurigheid en hoge veelzijdigheid, maar heeft een cruciale wisselwerking:variabele en vaak lage efficiëntie van de bewerkingsinstallatie. Met andere woorden:hoewel primaire bewerkingen met hoge precisie en met weinig ongewenste bijproducten kunnen worden uitgevoerd, slaagt de aanpak er vaak ook niet in om deze bewerkingen met een redelijke frequentie uit te voeren.
In een artikel dat in druk verscheen in het tijdschrift Nature op 18 april 2024 beschrijven Princeton-wetenschappers Jun Yan en Britt Adamson, samen met een aantal collega's, een efficiëntere hoofdredacteur.
Prime-bewerkingssystemen bestaan minimaal uit twee componenten:een aangepaste versie van het eiwitelement van CRISPR/Cas9 en een ribonucleïnezuur (RNA)-molecuul dat pegRNA wordt genoemd. Deze componenten werken samen in verschillende gecoördineerde stappen:eerst bindt het pegRNA het eiwit en leidt het resulterende complex naar de gewenste locatie in het genoom.
Daar kerft het eiwit het DNA en, met behulp van een sjabloonsequentie gecodeerd op het pegRNA, "reverse transcribeert" een bewerking in het nabijgelegen genoom. Op deze manier 'schrijven' hoofdredacteuren exacte sequenties in gericht DNA.
"Prime editing is zo'n ongelooflijk krachtig hulpmiddel voor het bewerken van genoom, omdat het ons meer controle geeft over hoe genomische sequenties precies worden veranderd", aldus Adamson.
Aan het begin van hun studie redeneerden Adamson en Yan, een afgestudeerde student in de onderzoeksgroep van Adamson en de afdeling Moleculaire Biologie, dat onbekende cellulaire processen prime editing kunnen helpen of belemmeren. Om dergelijke processen te identificeren, stelde Yan een conceptueel eenvoudig plan op:eerst zou hij een cellijn ontwerpen die groene fluorescentie zou uitzenden als bepaalde prime-bewerkingen waren geïnstalleerd. Vervolgens blokkeerde hij systematisch de expressie van eiwitten die normaal in die cellen tot expressie worden gebracht en meet hij door editing geïnduceerde fluorescentie om te bepalen welke van die eiwitten de primaire editing beïnvloeden.
Door dit plan uit te voeren identificeerde het team 36 cellulaire determinanten van primaire editing, waarvan er slechts één – het kleine RNA-bindende eiwit La – editing bevorderde.
"Hoewel het bevorderen van prime editing uiteraard geen normale functie van het La-eiwit is, hebben onze experimenten aangetoond dat het het proces sterk kan vergemakkelijken," zei Yan.
Het is bekend dat La in cellen specifieke sequenties bindt die vaak worden aangetroffen aan de uiteinden van opkomende kleine RNA-moleculen en dat het die RNA's beschermt tegen afbraak. Het team van Princeton herkende meteen dat de pegRNA's die in Yan's eerste experimenten werden ingezet waarschijnlijk die exacte sequenties bevatten, de zogenaamde polyuridinekanalen, omdat ze een typisch, maar vaak over het hoofd gezien bijproduct zijn van pegRNA-expressie in cellen. Daaropvolgende experimenten suggereerden dat dergelijke pegRNA's onbedoeld La's eindbindende activiteit benutten voor bescherming en om prime editing te bevorderen.
Gemotiveerd door hun resultaten vroeg het team zich af of het fuseren van het deel van La dat polyuridinekanalen bindt aan een standaard prime editing-eiwit de efficiëntie van prime editing zou kunnen verhogen. Ze waren blij toen ze ontdekten dat het resulterende eiwit, dat ze PE7 noemen, de beoogde primaire bewerkingsefficiëntie onder alle omstandigheden aanzienlijk verbeterde en, bij gebruik van sommige primaire bewerkingssystemen, de frequentie van ongewenste bijproducten erg laag liet.
Hun resultaten trokken al snel de aandacht van collega's die geïnteresseerd waren in het gebruik van prime editing in primaire menselijke cellen, waaronder Daniel Bauer van het Boston Children's Hospital en de Harvard Medical School en Alexander Marson van de Universiteit van Californië, San Francisco. Samen met wetenschappers uit deze laboratoria heeft het team van onderzoekers vervolgens aangetoond dat PE7 ook de efficiëntie van primaire bewerking in therapeutisch relevante celtypen kan verbeteren, wat een grotere belofte biedt voor toekomstige klinische toepassingen.
"Dit werk is een mooi voorbeeld van hoe diepgaand onderzoek naar de innerlijke werking van cellen kan leiden tot onverwachte inzichten die op korte termijn een biomedische impact kunnen hebben", aldus Bauer.