Volgens de BioWeb-website van de University of Wisconsin is een PCR-primer een kort, synthetisch oligonucleotide (meestal tussen 18 en 25 basen lang) dat wordt gebruikt om specifieke regio's van DNA te amplificeren in een moleculaire biologie techniek die bekend staat als polymerasekettingreactie (PCR) . Zowel een voorwaartse als een omgekeerde primer zijn nodig, ontworpen om omgekeerde complementen van de DNA-streng te zijn, om te flankeren en te binden aan het gewenste DNA-gebied. Wanneer wetenschappers onderzoek willen doen naar een specifiek gen of DNA-gebied, moeten ze eerst PCR uitvoeren om voldoende van de doelregio te verkrijgen om mee te werken. Het ontwerpen van primersequenties voor het interessegebied kan nodig zijn als ze niet al beschikbaar zijn via eerder gepubliceerd onderzoek of met commerciële middelen.

Verkrijg de nucleotidesequentie van het gen of DNA-gebied van interesse en beslis hoe lang een fragment je wilt versterken. De voorwaartse en achterwaartse primer is ontworpen om aan het begin en aan het einde van het gewenste fragment te binden. Normaal gesproken gebruiken conventionele PCR-methoden primers die een regio flankeren tussen 100 tot 1.000 basenparen lang, terwijl real-time PCR-methoden fragmenten gebruiken van ongeveer 50 tot 200 basenparen lang.

Bepaal waar in de reeks u de primers wilt hebben liegen. U wilt bijvoorbeeld de locatie dichtbij het 5'- of het 3'-uiteinde van de reeks of in het midden. Geef desgewenst de locatie van de primers op om een ​​intron te omspannen.

Volg de aanbevolen richtlijnen voor primerontwerp. Succesvolle amplificatie van het DNA-product hangt af van de kwaliteit van de primers en bepaalde variabelen zijn van cruciaal belang.

Ontwerpprimers zijn 18 tot 24 basen lang. Vincent R. Prezioso, Ph.D., van Brinkmann Instruments Inc., suggereert dat deze lengte lang genoeg is om extreem specifiek te zijn voor het gewenste DNA-gebied, maar kort genoeg om gemakkelijk te binden (anneal). De smelttemperatuur van de primer (Tm) moet tussen 55 en 80 graden Celsius zijn, laag genoeg om volledig smelten bij of boven 90 graden Celsius mogelijk te maken, maar hoog genoeg om gloeien mogelijk te maken. Het GC-gehalte (percentage van G's en C's in de reeks) moet tussen 40 en 60 procent zijn. Het 3'-uiteinde van de primersequentie moet eindigen in een C of een G (een GC-klem genoemd) om de binding te bevorderen, omdat de G- en C-nucleotiden sterkere bindingen hebben, maar vermijd drie of meer G's of C's in de laatste vijf basis van de reeks.

Vermijd runs van vier of meer van één base (zoals ACCCC ...) of vier of meer di-nucleotide herhalingen (zoals ATATATAT ...) omdat ze mispriming kunnen veroorzaken. Ontwerp-primers zonder intra-primer homologie (meer dan drie basen die binnen de ene primer zelf complementeren) of inter-primer homologie (waarbij de forward en reverse primer complementaire sequenties hebben). Dit kan zelfdimeren of primerdimeren veroorzaken, waarbij de primers aan zichzelf binden in plaats van aan de gewenste DNA-sequentie te binden.

Gebruik online bronnen en websites die helpen bij het ontwerpen van primers of helpen bij het controleren van primer-sequenties voor zelfstudie. complementariteit of het potentieel om secundaire structuren zoals haarspelden te maken. Sommige primer-ontwerpwebsites zijn onder andere het Massachusetts Institute of Technology's Primer3, National Center for Biotechnology Information's Primer-Blast en Integrated OligoAnalyzer voor DNA-technologieën.