Een team van nanobiotechnologen van het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering van Harvard en het Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) onder leiding van William Shih, lid van de Wyss Founding Core Faculty, doctoraat, heeft een programmeerbare DNA-zelfassemblagestrategie bedacht die de belangrijkste uitdaging van robuuste nucleatiecontrole oplost en de weg vrijmaakt voor toepassingen zoals ultragevoelige diagnostische biomarkerdetectie en schaalbare fabricage van micrometer-achtige structuren met functies van nanometer-formaat.

Met behulp van de methode, genaamd "kruiselingse polymerisatie", de onderzoekers kunnen het weven van nanolinten van langwerpige enkelvoudige DNA-strengen (aangeduid als "latten") initiëren door een strikt zaadafhankelijke kiemvormingsgebeurtenis. De studie is gepubliceerd in Natuurcommunicatie .

DNA-nanostructuren hebben een groot potentieel voor het oplossen van verschillende diagnostische, therapeutisch, en fabricage-uitdagingen vanwege hun hoge biocompatibiliteit en programmeerbaarheid. Om effectieve diagnostische apparaten te laten functioneren, bijvoorbeeld, een DNA-nanostructuur moet mogelijk specifiek reageren op de aanwezigheid van een doelmolecuul door een versterkte uitlezing te activeren die compatibel is met goedkope instrumenten die toegankelijk zijn in point-of-care of klinische laboratoriumomgevingen.

De meeste DNA-nanostructuren worden geassembleerd met behulp van een van de twee hoofdstrategieën die elk hun sterke punten en beperkingen hebben. "DNA-origami" wordt gevormd uit een lange enkelstrengige steigerstreng die wordt gestabiliseerd in een twee- of driedimensionale configuratie door talrijke kortere stapelstrengen. Hun montage is strikt afhankelijk van de steigerstreng, wat leidt tot robuust alles-of-niets vouwen. Hoewel ze met een hoge zuiverheid kunnen worden gevormd in een breed scala van omstandigheden, hun maximale grootte is beperkt. "DNA-stenen" daarentegen kunnen veel grotere structuren samenstellen uit een groot aantal korte modulaire strengen. Echter, hun assemblage vereist streng gecontroleerde omgevingsomstandigheden, kan oneigenlijk worden gestart in de afwezigheid van een zaadje, en produceert een aanzienlijk deel van onvolledige structuren die moeten worden weggezuiverd.

"De introductie van DNA-origami was de meest impactvolle vooruitgang op het gebied van DNA-nanotechnologie in de afgelopen twee decennia. De kriskras-polymerisatiebenadering die we in deze studie hebben ontwikkeld, bouwt voort op deze en andere fundamenten om gecontroleerde DNA-zelfassemblage tot veel grotere lengteschalen, " zei Shih, die mede-leider is van het Wyss' Molecular Robotics Initiative, en is ook professor aan de Harvard Medical School en DFCI. "We stellen ons voor dat kriskras polymerisatie in grote lijnen de vorming van alles-of-niets van twee- en driedimensionale microstructuren met adresseerbare kenmerken op nanoschaal mogelijk zal maken, algoritmische zelfassemblage, en nul-achtergrond signaalversterking in diagnostische toepassingen die extreme gevoeligheid vereisen."

Een zaadje planten

Na de beperkingen van DNA-origami en DNA-steen-nanostructuren te hebben ervaren, het team begon met de vraag of het mogelijk was om de absolute zaadafhankelijkheid van DNA-origami-assemblage te combineren met de grenzeloze grootte van DNA-steenconstructies in een derde type DNA-nanostructuur die snel en consistent tot een grote omvang groeit.

"We voerden aan dat alles-of-niets-assemblage van DNA-structuren op micronschaal zou kunnen worden bereikt door een systeem te ontwerpen met een hoge vrije-energiebarrière voor spontane assemblage. De barrière kan alleen worden omzeild met een zaadje dat een set bindt en rangschikt van 'kiemvormende' lamellen voor het gezamenlijk opvangen van 'groei' lamellen. Dit brengt een kettingreactie van groei-lat toevoegingen op gang die resulteert in lange DNA-linten, " zei mede-eerste auteur Dionis Minev, doctoraat, die een postdoctoraal onderzoeker is in het team van Shih.

"Dit soort zeer coöperatieve, strikt zaadafhankelijke kiemvorming volgt enkele van dezelfde principes die de initiatie en groei van cytoskelet-actine of microtubuli-filament in cellen bepalen." De verlenging van cytoskelet-filamenten volgt strikte regels waarbij elk binnenkomend monomeer bindt aan verschillende monomeren die eerder in het polymere filament zijn opgenomen en op zijn beurt is nodig voor de binding van de volgende. "Crisscross polymerisatie tilt deze strategie naar een hoger niveau door het mogelijk te maken dat niet-dichtstbijzijnde buren nodig zijn voor rekrutering van binnenkomende monomeren. Het resulterende extreme niveau van coördinatie is de geheime saus, ' zei Minev.

Van concept naar daadwerkelijke structuur(s)

Hun concept in de praktijk brengen, het team ontwierp en valideerde een systeem waarin een kleine zaadstructuur een hoge startconcentratie van voorgevormde bindingsplaatsen biedt in de vorm van uitstekende enkele DNA-strengen. Deze kunnen worden gedetecteerd door DNA-latten met zes (of in een alternatief kriskras systeem acht) beschikbare bindingsplaatsen, elke binding aan een van de zes (of acht) aangrenzende uitstekende ssDNA-strengen in een kriskras patroon, en daaropvolgende DNA-latten worden dan continu aan de langwerpige structuur toegevoegd.

"Ons ontwerp is opmerkelijk omdat we een snelle groei van enorme DNA-structuren hebben bereikt, maar met nucleatiecontrole die ordes van grootte groter is dan andere benaderingen. Het is alsof je je cake hebt en hem ook opeet, omdat we gemakkelijk grootschalige vergaderingen creëerden en dat alleen deden waar en wanneer we dat wilden, " zei co-eerste auteur Chris Wintersinger, een doctoraat student in de groep van Shih die aan het project samenwerkte met Minev. "De controle die we hebben bereikt met kriskras overtreft aanzienlijk die waargenomen voor bestaande DNA-methoden waarbij nucleatie alleen kan worden gestuurd binnen een smal venster van omstandigheden waar de groei buitengewoon langzaam is."

Met behulp van kruiselingse polymerisatie, Shih's team genereerde DNA-linten die zichzelf assembleerden als resultaat van een enkele specifieke seeding-gebeurtenis in structuren die tot tientallen micrometers lang waren, met een massa die bijna honderd keer groter is dan een typische DNA-origami. Bovendien, door gebruik te maken van de hoge programmeerbaarheid van lamellen conformaties en interacties, de onderzoekers creëerden linten met verschillende bochten en wendingen, resulterend in opgerolde en buisachtige structuren.

In toekomstige studies, dit kan worden benut om gefunctionaliseerde structuren te creëren die kunnen profiteren van ruimtelijk gescheiden compartimenten. "Een onmiddellijke toepassing voor onze kriskras nanoconstructiemethode is als een amplificatiestrategie in diagnostische tests na de vorming van nanozaden uit specifieke en zeldzame biomarkers, " zei co-auteur Anastasia Ershova, die ook een Ph.D. student begeleid door Shih.

"De ontwikkeling van deze nieuwe nanofabricagemethode is een treffend voorbeeld van hoe het Molecular Robotics Initiative van het Wyss Institute geïnspireerd blijft door biologische systemen, in dit geval, groeiende cytoskeletale filamenten, en blijft de mogelijkheden op dit spannende gebied uitbreiden. Deze vooruitgang brengt het potentieel van DNA-nanotechnologie dichter bij het oplossen van dringende diagnostische uitdagingen waarvoor momenteel geen oplossingen zijn. " zei Wyss oprichter Donald Ingber, MD, doctoraat, die ook de Judah Folkman Professor of Vascular Biology is aan de Harvard Medical School en het Boston Children's Hospital, en hoogleraar bio-engineering aan de Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.