(Phys.org) — DNA-sequencing is de drijvende kracht achter belangrijke ontdekkingen in de geneeskunde en biologie. Bijvoorbeeld, de volledige sequentie van het genoom van een individu levert belangrijke markers en richtlijnen voor medische diagnostiek en gezondheidszorg. Tot nu toe, de belangrijkste wegversperring waren de kosten en snelheid van het verkrijgen van zeer nauwkeurige DNA-sequenties. Hoewel er de afgelopen 10 jaar veel vooruitgang is geboekt, de meeste huidige high-throughput sequencing-instrumenten zijn afhankelijk van optische technieken voor de detectie van de vier bouwstenen van DNA:A, C, G en T. Om het meetvermogen verder te verbeteren, elektronische DNA-sequencing van een ensemble van DNA-templates is ook ontwikkeld.

Onlangs, het is aangetoond dat DNA door de poriën van eiwitten op nanoschaal kan worden geregen onder een aangelegde elektrische stroom om elektronische signalen op enkel molecuulniveau te produceren. Echter, omdat de vier nucleotiden erg op elkaar lijken in hun chemische structuren, ze kunnen niet gemakkelijk worden onderscheiden met behulp van deze techniek. Dus, het onderzoek en de ontwikkeling van een elektronisch DNA-sequencingplatform met één molecuul is het meest actieve onderzoeksgebied en heeft het potentieel om een ​​draagbare DNA-sequencer te produceren die het genoom kan ontcijferen voor gepersonaliseerde geneeskunde en fundamenteel biomedisch onderzoek.

Een team van onderzoekers van de Columbia University, onder leiding van Dr. Jingyue Ju (de Samuel Ruben-Peter G. Viele Professor of Engineering, Hoogleraar Chemische Technologie en Farmacologie, directeur van het Centrum voor Genoomtechnologie en Biomoleculaire Engineering), met collega's van het National Institute of Standards and Technology (NIST) onder leiding van Dr. John Kasianowicz (Fellow van de American Physical Society), hebben een nieuwe benadering ontwikkeld om mogelijk DNA in nanoporiën elektronisch te sequencen op het niveau van een enkel molecuul met een resolutie van één base. Dit werk, getiteld "PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis" is nu beschikbaar in het open access online tijdschrift, Wetenschappelijke rapporten , van de Nature Publication-groep.

De gerapporteerde op nanoporiën gebaseerde sequencing door synthese (Nano-SBS) -strategie kan nauwkeurig vier DNA-basen onderscheiden door 4 tags van verschillende grootte te detecteren die zijn vrijgegeven uit 5'-fosfaat-gemodificeerde nucleotiden op het niveau van één molecuul voor sequentiebepaling. Het basisprincipe van de Nano-SBS-strategie wordt als volgt beschreven. Omdat elke nucleotide-analoog tijdens de polymerasereactie in de groeiende DNA-streng wordt opgenomen, de tag wordt vrijgegeven door de vorming van fosfodiesterbindingen. De tags gaan een nanoporie binnen in de volgorde van hun vrijlating, het produceren van unieke ionenstroomblokkadesignaturen vanwege hun verschillende chemische structuren, waardoor de DNA-sequentie elektronisch wordt bepaald op het niveau van een enkel molecuul met een resolutie van een enkele base. Als proof-of-principle, het onderzoeksteam hechtte vier polymeertags van verschillende lengte aan het terminale fosfaat van 2'-deoxyguanosine-5'-tetrafosfaat (een gemodificeerde DNA-bouwsteen) en toonde efficiënte opname van de nucleotide-analogen tijdens de polymerasereactie, evenals beter dan basislijndiscriminatie tussen de vier tags op enkel molecuulniveau op basis van hun nanopore ionische stroomblokkadesignaturen. Deze benadering in combinatie met polymerase gehecht aan de nanoporiën in een array-formaat zou een elektronisch Nano-SBS-platform met één molecuul moeten opleveren.

In eerder werk, het Center of Genome Technology &Biomolecular Engineering aan de Columbia University, onder leiding van professor Ju en dr. Nicholas J. Turro (William P. Schweitzer hoogleraar scheikunde), ontwikkelde een vierkleuren DNA-sequencing door synthese (SBS) platform met behulp van splitsbare fluorescerende nucleotide omkeerbare terminators (NRT), die in licentie is gegeven aan Intelligent Bio-Systems, Inc., een QIAGEN-bedrijf. SBS met splitsbare fluorescerende NRT's is de dominante benadering die wordt gebruikt in de volgende generatie DNA-sequencingsystemen. Dr. Kasianowicz en zijn groep bij NIST waren pioniers in het onderzoek naar nanoporiën voor analyse van enkelvoudige moleculen. Ze meldden eerder dat polymeren van verschillende lengte, polyethyleenglycolen (PEG's), konden worden onderscheiden door hun unieke effecten op de huidige metingen in een α-hemolysine-eiwit nanoporiën op enkel molecuulniveau en vervolgens een theorie voor de methode ontwikkeld. Hun resultaten bieden het proof-of-concept voor massaspectrometrie met één molecuul. De combinatie van het SBS-concept met de afzonderlijke nanoporiën-detecteerbare elektronische tags om DNA-bouwstenen te labelen, leidde tot de ontwikkeling van de elektronische Nano-SBS-benadering met één molecuul. Wetenschappelijke rapporten artikel.

Zoals hoofdauteur Dr. Shiv Kumar opmerkt, "De nieuwigheid van onze aanpak ligt in het ontwerp en het gebruik van vier verschillend gelabelde nucleotiden, die bij opname door DNA-polymerase, laat vier tags van verschillende grootte los die van elkaar worden onderscheiden op het niveau van een enkel molecuul wanneer ze door de nanoporie gaan. Deze benadering overwint alle beperkingen die worden opgelegd door de kleine verschillen tussen de vier nucleotiden, een uitdaging waarmee de meeste nanopore-sequencingmethoden al tientallen jaren worden geconfronteerd." de techniek is vrij flexibel; met PEG-tags als prototypes, andere chemische tags kunnen worden gekozen om optimale scheiding in verschillende nanoporiesystemen te bieden.

Met de verdere ontwikkeling van deze Nano-SBS-aanpak, zoals het gebruik van grote reeksen eiwitten of vaste nanoporiën, dit systeem heeft het potentieel om snel en tegen lage kosten een volledig menselijk genoom nauwkeurig te sequencen, waardoor het kan worden gebruikt bij routinematige medische diagnoses.