(Phys.org) -- Onderzoekers van het Georgia Institute of Technology en de University of California San Francisco hebben geavanceerde wetenschappers in staat om een ​​duidelijk beeld te krijgen van een enkele cellulaire structuur in beweging. Door moleculen te identificeren met behulp van gecomprimeerde waarneming, deze nieuwe methode biedt de benodigde ruimtelijke resolutie plus een snellere temporele resolutie dan voorheen mogelijk was.

Ondanks de vele successen op het gebied van superresolutiemicroscopie in de afgelopen jaren met vooruitgang in ruimtelijke resolutie, live-cell imaging is een uitdaging gebleven vanwege de behoefte aan een hoge temporele resolutie.

Nutsvoorzieningen, Lei Zhu, assistent-professor aan de George W. Woodruff School of Mechanical Engineering van Georgia Tech, en Bo Huang, assistent-professor bij de afdeling Farmaceutische Chemie en de afdeling Biochemie en Biofysica van UCSF, hebben een geavanceerde benadering ontwikkeld met behulp van superresolutiemicroscopie om cellulaire kenmerken op te lossen die een orde van grootte kleiner zijn dan wat eerder kon worden gezien. Hierdoor kunnen de onderzoekers voorheen ontoegankelijke informatie aanboren en nieuwe biologische vragen beantwoorden.

Het onderzoek is op 22 april gepubliceerd, 2012 in het tijdschrift Natuurmethoden . Het onderzoek wordt gefinancierd door de National Institutes of Health, UCSF-programma voor baanbrekend biomedisch onderzoek, Searle Scholarship en Packard Fellowship voor wetenschap en techniek.

De vorige technologie die de single-molecule-switching-benadering voor superresolutiemicroscopie gebruikt, hangt af van het dun verspreiden van afbeeldingen van enkele moleculen in vele, vaak duizenden, cameraframes. Het is extreem beperkt in zijn temporele resolutie en biedt niet de mogelijkheid om dynamische processen in levende cellen te volgen.

"We kunnen onze ontdekking nu gebruiken met behulp van superresolutiemicroscopie met een resolutie van seconden of zelfs minder dan een seconde voor een groot gezichtsveld om veel meer dynamische cellulaire processen te volgen, ' zei Zhu. "Veel van onze kennis over het leven van een cel komt voort uit ons vermogen om de kleine structuren erin te zien."

Huang merkte op, “Eén aanvraag, bijvoorbeeld, is om te onderzoeken hoe mitochondriën, de krachtcentrale van de cel, interageren met andere organellen en het cytoskelet om de structuur tijdens de levenscyclus van de cel te hervormen."

Momenteel, lichtmicroscopie, vooral in de moderne vorm van fluorescentiemicroscopie, wordt nog steeds veel gebruikt door veel biologen. Echter, de auteurs zeggen, conventionele lichtmicroscopie heeft één belangrijke beperking:het onvermogen om twee objecten dichterbij dan de helft van de golflengte van het licht te onderscheiden vanwege het fenomeen dat diffractie wordt genoemd. Met diffractie, de afbeeldingen zien er wazig en overlappend uit, ongeacht hoe hoog de vergroting wordt gebruikt.

"De diffractielimiet werd lang beschouwd als een van de fundamentele beperkingen voor lichtmicroscopie tot de recente uitvindingen van superresolutie-fluorescentiemicroscopietechnieken, ' zei Zhu. Superresolutiemicroscopiemethoden, zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) of foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), vertrouwen op het vermogen om lichtemissie van een enkel molecuul in het monster te registreren.

Met behulp van sondemoleculen die kunnen worden geschakeld tussen een zichtbare en een onzichtbare toestand, STORM/PALM bepaalt de positie van elk van belang zijnd molecuul. Deze posities bepalen uiteindelijk een structuur.

De nieuwe bevinding is belangrijk, zeiden Zhu en Huang, omdat ze hebben aangetoond dat de technologie het mogelijk maakt om de dynamiek van een cytoskelet van microtubuli te volgen met een tijdsresolutie van drie seconden, waarmee onderzoekers het actieve transport van blaasjes en andere ladingen in de cel zouden kunnen bestuderen.

Met hetzelfde optische systeem en dezelfde detector als bij conventionele lichtmicroscopie, superresolutiemicroscopie vereist natuurlijk een langere acquisitietijd om meer ruimtelijke informatie te verkrijgen, wat leidt tot een afweging tussen de ruimtelijke en temporele resolutie. In superresolutiemicroscopiemethoden op basis van STORM/PALM, elk camerabeeld bemonstert een zeer schaarse subset van sondemoleculen in het monster.

Een alternatieve benadering is om de dichtheid van geactiveerde fluoroforen te verhogen, zodat elk cameraframe meer moleculen bemonstert. Echter, deze hoge dichtheid van fluorescerende vlekken zorgt ervoor dat ze elkaar overlappen, het ongeldig maken van de veelgebruikte lokalisatiemethode met één molecuul.

De auteurs zeiden dat recentelijk een aantal methoden zijn gerapporteerd die op efficiënte wijze posities van één molecuul kunnen achterhalen, zelfs wanneer de signalen van de enkele fluorofoor elkaar overlappen. Deze methoden zijn gebaseerd op het aanpassen van clusters van overlappende plekken met een variabel aantal point-spread-functies (PSF's) met ofwel maximale waarschijnlijkheidsschatting of Bayesiaanse statistieken. De Bayesiaanse methode is ook toegepast op de hele beeldset.

Als resultaat van nieuw onderzoek, Zhu en Huang presenteren een nieuwe benadering op basis van globale optimalisatie met behulp van gecomprimeerde detectie, waarbij het aantal moleculen in de afbeelding niet wordt geschat of aangenomen. Ze laten zien dat gecomprimeerde detectie kan werken met veel hogere molecuuldichtheden in vergelijking met andere technologieën en demonstreren live-celbeeldvorming van fluorescerende eiwit-gelabelde microtubuli met een temporele resolutie van drie seconden.

Het STORM-experiment dat door de auteurs is gebruikt, met immunologisch gekleurde microtubuli in Drosophila melanogaster S2-cellen, aangetoond dat nabijgelegen microtubuli kunnen worden opgelost door gecomprimeerde waarneming met slechts 100 cameraframes, terwijl ze niet waarneembaar waren door de methode voor het aanmeten van één molecuul. Ze hebben ook live STORM uitgevoerd op S2-cellen die tubuline stabiel tot expressie brengen dat is gefuseerd met mEos2.

Bij de veelgebruikte framesnelheid van een camera van 56,4 Hertz, een film met superresolutie werd geconstrueerd met een tijdresolutie van drie seconden (169 frames) en een Nyquist-resolutie van 60 nanometer, veel sneller dan eerder gemeld, zeiden Zhu en Huang. Deze resultaten hebben bewezen dat gecomprimeerde detectie STORM in staat kan stellen om live cellulaire processen te volgen met een tijdresolutie op de tweede schaal, of zelfs een resolutie van minder dan een seconde als een snellere camera kan worden gebruikt.