Science >> Wetenschap >  >> Fysica

Foton-voor-foton afbeeldingen bouwen om de informatie-inhoud van microscopen te vergroten

Een nieuw ontwikkelde compacte ISM-microscoop uitgerust met een single photon lawine diode (SPAD) array-detector zorgt voor structurele en functionele beeldvorming met hoge resolutie. Krediet:A. Zunino (ITT).

De wereld van laserscanmicroscopie evolueert snel, dankzij de komst van snelle en compacte detectorarrays. Deze arrays vervangen de typische detector met één element van traditionele confocale laserscanmicroscopen, waardoor nieuwe en unieke mogelijkheden mogelijk worden.



Terwijl conventionele detectoren alleen de intensiteitswaarde van het verzamelde licht weergeven, maakt een gepixelde detector ook de ruimtelijke verdeling van invallend licht mogelijk, waardoor voor elk scanpunt effectief een klein beeld van het verlichte gebied wordt opgebouwd.

De extra ruimtelijke informatie die door de detectorarrays wordt geleverd, maakt een superresolutietechniek mogelijk die bekend staat als beeldscanmicroscopie (ISM). ISM bouwt op computationele wijze een enkel beeld op uit een onbewerkte multidimensionale dataset geproduceerd door een microscoop. Het uiteindelijke beeld is opgebouwd met een betere signaal-ruisverhouding (SNR), optische secties en ruimtelijke resolutie dan die van een traditionele confocale microscoop.

In detail kan de laterale resolutie van het ISM-beeld de limiet van Abbe tot een factor twee overtreffen. Deze voordelen worden echter bereikt door alleen ruimtelijke informatie te exploiteren; moderne fluorescentiebio-imaging kan verder worden verrijkt door tijdsopgeloste acquisitie, die toegang mogelijk maakt tot structurele en functionele informatie die is gecodeerd in de fluorescentiedynamiek (bijvoorbeeld de levensduur van de fluorescentie).

Onlangs hebben onderzoekers van het Italian Institute of Technology (IIT) in Genua een compacte en effectieve ISM-microscoop ontwikkeld, uitgerust met een single photon lawine diode (SPAD) array-detector die structurele en functionele beeldvorming met hoge resolutie in één enkele architectuur kan leveren. Het onderzoek is gepubliceerd in Advanced Photonics .

De gerapporteerde SPAD-arraydetector bestaat uit 25 onafhankelijke diodes die in een vierkant rooster zijn gerangschikt. Het kleine formaat en de asynchrone uitlezing maken een snelle detectie van invallende fluorescentiefotonen mogelijk. Het data-acquisitieschema, gebaseerd op de Digital Frequency Domain (DFD)-methode, is een heterodyne samplingtechniek die de constructie van het fluorescentievervalhistogram mogelijk maakt met een timingresolutie tot 400 ps, ​​geschikt voor de meeste toepassingen voor fluorescentiebeeldvorming.

(a) Vergelijking van confocale en ISM-fluorescentielevensduurkaarten van tubulinefilamenten van een HeLa-cel. (b) Vergelijking van onbewerkt STED- en ISM-SPLIT-STED-beeld van tubulinefilamenten. (c) Phasor-weergave van twee kleurstoffen met dezelfde levensduur en overlappende excitatiespectra, individueel geëxciteerd door twee verschillende laserpulsen (boven). Phasor-weergave van de gemengde bijdragen van de twee kleurstoffen (onder). (d) Kanaalscheiding met behulp van tijdgating (links) en fasescheiding (rechts). Vanwege overspraak kan alleen fasescheiding de twee kleurstoffen met succes onderscheiden. Krediet:Tortarolo, Zunino, et al., doi 10.1117/1.AP.6.1.016003.

De techniek is eenvoudig genoeg om histogramberekeningen mogelijk te maken op hetzelfde field-programmable-gate-array (FPGA) bord dat wordt gebruikt om de microscoop te besturen en het gedetecteerde signaal op te nemen, waardoor de microscooparchitectuur wordt vereenvoudigd.

Dankzij de unieke ruimtelijke en temporele informatie die door de SPAD-arraydetector wordt geleverd, demonstreerden de auteurs de combinatie van metingen van de fluorescentielevensduur (FL) met ISM (FLISM). Naast de conventionele ISM-voordelen maakt de verbeterde SNR van de FLISM-beelden een robuustere schatting van de fluorescentielevensduur mogelijk.

Het rapport belicht de veelzijdigheid van de microscoop door ISM en tijdsopgeloste metingen te combineren met gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie, met behulp van de Separation by Lifetime Tuning (SPLIT) techniek. Het resultaat is een beeld met verbeterde laterale resolutie en contrast, verkregen zonder het acquisitieschema te wijzigen. Bovendien maken tijdsopgeloste metingen beeldvorming van meerdere soorten mogelijk met één enkele detector, voor een grotere structurele specificiteit.

Het systeem kan verschillende kleurstoffen onderscheiden op basis van hun fluorescentielevensduurwaarden, dankzij de fasorrepresentatie van de fluorescentiedynamiek. Zelfs door kleurstoffen met vergelijkbare levensduurwaarden en overlappende excitatiespectra te gebruiken, kan het de verschillende fluoroforen onderscheiden met behulp van de pulsed-interleaving excitatietechniek.

Door de excitatiepulsen van de laser met verschillende kleuren af ​​te wisselen, wordt de spectrale informatie effectief gecodeerd in de temporele dimensie. Dankzij de uitstekende tijdresolutie van de voorgestelde microscoop kan de bijdrage van de twee fluorescerende kleurstoffen later worden gescheiden om overspraak te voorkomen.

Volgens Giuseppe Vicidomini, hoofdonderzoeker bij het Molecular Microscopy and Spectroscopie lab bij IIT en corresponderend auteur:"De resultaten van dit werk suggereren dat de toekomst van laserscanmicroscopie nauw verbonden is met SPAD-arraydetectoren, die in staat zijn de microscopiedataset te verrijken met extra ruimtelijke en temporele informatie zonder de noodzaak om de optische architectuur van een confocale microscoop te veranderen."

Het werk toont aan dat SPAD-arraydetectoren, gecombineerd met een op maat gemaakt acquisitiesysteem, foton-opgeloste ISM gemakkelijk toegankelijk en bruikbaar maken.

Meer informatie: Giorgio Tortarolo et al, Compacte en effectieve foton-opgeloste beeldscanmicroscoop, Geavanceerde fotonica (2024). DOI:10.1117/1.AP.6.1.016003

Geleverd door SPIE




Meer >

Meer >

Hoofdlijnen

  1. Bestaan ​​er nog grote onontdekte soorten?
  2. Waarom hebben de meeste mensen 23 paar chromosomen?
  3. Wat zijn twee kenmerken van mRNA in eukaryoten?
  4. Bevat RNA een genetische code?
  5. Een 3D-model van een plantencel bouwen
  6. Verschil tussen bacterie- en plantencel Wall
  7. Zal op cel gebaseerde melk de zuivelindustrie veranderen? Dit laboratorium in Californië kan het voortouw nemen
  8. eDNA gebruiken om de broedhabitat van bedreigde diersoorten te identificeren
  9. Een geïntegreerde beoordeling van vaatplantensoorten in Amerika

Wetenschap