Een onderzoeksgroep onder leiding van professor MATOBA Osamu (Organization for Advanced and Integrated Research) van Kobe University heeft met succes 3D fluorescentie- en fasebeeldvorming van levende cellen gecreëerd op basis van digitale holografie. Ze gebruikten plantencellen met fluorescerende eiwitmarkers in hun kernen om dit beeldvormingssysteem te demonstreren.

De groep bestond uit Project Assistant Professor Manoj KUMAR en Assistant Professor Xiangyu QUAN (beiden van de Graduate School of System Informatics), Professor AWATSUJI Yasuhiro (Kyoto Institute of Technology) en universitair hoofddocent TAMADA Yosuke (Utsunomiya University).

Deze technologie zal de basis vormen voor beeldvorming van levende cellen, wat onmisbaar is op het gebied van life sciences. Ook wordt verwacht dat het gebruik van deze technologie om stamcelprocessen in planten te visualiseren ons begrip ervan zal vergroten.

Deze onderzoeksresultaten verschenen in het tijdschrift Wetenschappelijke rapporten , gepubliceerd door Springer Nature op 15 mei.

Onderzoeksachtergrond

De optische microscoop werd uitgevonden aan het einde van de zestiende eeuw en de Britse wetenschapper Robert Hooke was de eerste die cellen ontdekte in het midden van de zeventiende eeuw. De uitvinding is ontwikkeld tot nieuwe technologieën zoals de fasecontrastmicroscoop (1953 Nobelprijs voor de natuurkunde), waardoor levende cellen kunnen worden geobserveerd zonder dat ze moeten worden gekleurd, en fluorescerende cellulaire beeldvorming, waarin specifieke moleculen worden gemarkeerd met behulp van fluorescerende eiwitten (Nobelprijs voor Scheikunde 2008) en waargenomen in levende cellen. Dit zijn essentiële instrumenten geworden voor observatie in life sciences en medische gebieden.

Fasebeeldvorming gebruikt het verschil in de optische lengte van het licht wanneer het door een biologisch monster gaat om structurele informatie erover te onthullen. Fluorescentiebeeldvorming geeft informatie over specifieke moleculen in het biologische monster, en kunnen hun functies onthullen. Echter, de intracellulaire structuur en beweeglijkheid zijn complex. Het vermogen om multidimensionale fysieke informatie te visualiseren die fase- en fluorescentiebeeldvorming omvat, zou nuttig zijn om deze aspecten te begrijpen. Een beeldvormingssysteem dat gelijktijdig en onmiddellijk gevarieerde fysieke informatie zou kunnen genereren uit 3D-levende cellen, zou als basistechnologie dienen voor het tot stand brengen van innovatie in de biologie.

Het hybride multimodale beeldvormingssysteem dat in deze studie is geconstrueerd, kan fase- en fluorescerende 3D-informatie in één keer verkrijgen. Het stelt onderzoekers in staat om de structurele of functionele informatie van een biologisch monster kwantitatief en gelijktijdig te visualiseren met behulp van een enkel platform.

onderzoeksmethode

In dit onderzoek, de onderzoekers construeerden een multimodale digitale holografische microscoop die tegelijkertijd de fluorescerende informatie en fase-informatie van een monster kon opnemen (Figuur 1). Dit gebruikt digitale holografie als basis, waarbij gestoorde lichtinformatie van het object wordt vastgelegd en vervolgens optische berekeningen gemaakt door de computer worden gebruikt om 3D ruimtelijke informatie over het object te genereren.

De microscoop in het onderzoek is samengesteld uit twee verschillende optische systemen. Ten eerste, het holografische 3D-fluorescentiebeeldvormingssysteem, zoals weergegeven aan de rechterkant van figuur 1. Om de 3D-fluorescentie-informatie te verkrijgen, een ruimtelijke lichtmodulator wordt gebruikt om het fluorescerende licht dat wordt uitgezonden door fluorescerende moleculen te splitsen in twee lichtgolven die met elkaar kunnen interfereren.

Op dit punt, de 3D-informatie van het objectlicht blijft behouden door een van de lichtgolven een iets andere krommingsstraal en voortplantingsrichting te geven; tegelijkertijd, de twee lichtgolven bevinden zich op een gedeeld optisch pad (meestal langs dezelfde as) waardoor een tijdelijk stabiele interferentiemeting kan worden uitgevoerd. Dit optische systeem werd geformuleerd in deze studie, de geregistreerde interferentie-intensiteitsverdeling voor de eerste keer verduidelijken. Met deze formule konden de onderzoekers experimentele omstandigheden vinden die de kwaliteit van de gereconstrueerde fluorescerende beelden zouden verbeteren. Ze waren in staat om driedimensionale beelden van levende cellen en hun structuren te genereren door dit fluorescerende 3D holografische systeem toe te passen. De moleculen en structuren van levende cellen werden gelabeld met fluorescerende eiwitten, waardoor hun dynamische gedrag kan worden waargenomen via deze nieuwe 3D-fluorescentiemicroscopie.

De beeldvormingstechnologie die door deze studie is ontwikkeld, maakt 3D-beelden mogelijk, die tot nu toe relatief langer duurden om te genereren via laserscanning, in één keer worden gegenereerd zonder dat u hoeft te scannen.

Volgende, zoals afgebeeld aan de linkerkant van figuur 1, is het holografische 3D-fasebeeldvormingssysteem. Een levende plantencel bestaat uit componenten zoals een kern, mitochondriën, chloroplasten, en een dunne celwand. Het is mogelijk om de structuren van deze componenten te visualiseren door de verschillen in fase (optische weglengte). In dit systeem, door de Mach-Zehnder-interferometer te gebruiken, kan de referentievlakgolf worden gebruikt, waardoor de optimale interferentierand voor elk gemeten object gemakkelijk kan worden verkregen.

Deze digitale holografische microscoop is gemaakt door fluorescentie- en fasemeetsystemen te verenigen.

Vervolgens, deze microscoop werd gebruikt om levende plantencellen te visualiseren. Er is een experiment uitgevoerd om te bewijzen dat het mogelijk is om 4D-waarnemingen te doen door ruimtelijke 3D en een (eendimensionale) tijdas toe te passen. Het mos Physcomitrella patens en fluorescerende kralen met een gemiddelde grootte van 10 m werden gebruikt. Figuren 2 en 3 tonen de experimentresultaten voor gelijktijdige 3D-fluorescentie en fasebeeldvorming van het mos. Figuur 2 (b) laat zien dat zeven kernen zichtbaar zijn wanneer een conventionele full-field fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt. Van deze zeven de kernen genummerd 1, 2, en 4 zijn in focus, echter, dit is niet het geval voor de kernen op locaties op verschillende diepten, aangezien het een zwak fluorescerend beeld is met wijdverbreide vervaging. In de voorgestelde methodologie van deze studie om dit probleem op te lossen, fluorescerende lichtgolfinformatie werd geëxtraheerd uit het fluorescerende hologram in figuur 2 (c). Op basis van deze informatie, het numerieke Fresnel-voortplantingsalgoritme kan op elke diepte of afstand gereconstrueerde fluorescerende beelden verkrijgen. Daarom, in-focus afbeeldingen van meerdere fluorescerende kernen op verschillende diepten werden hersteld van een enkel beeld zonder te scannen.

Figuur 2 (d), (e), en (f) toon de gereconstrueerde beelden op drie verschillende vlakken. De axiale afstand tussen (d) en (e) is 10 micrometer, en 15 micrometer tussen (e) en (f). De gele pijlen geven de kernen aan die in focus zijn. Het is mogelijk om te zien welke van de zeven kernen in het fluorescentiebeeld in focus zijn over de drie vlakken.

Figuur 3 toont de kwantitatieve faseverdeling voor de drie vlakken op verschillende diepten. Het was mogelijk om individuele chloroplasten te visualiseren (er zijn er veel rond de randen van de cellen, zoals aangegeven door de rode pieken in figuur 3 (b)). De celdikte, zoals berekend uit de gemeten kwantitatieve fasewaarden, was ongeveer 17 micrometer, een grootte die zeer dicht bij andere referentiewaarden ligt.

In figuur 4, je ziet fluorescerende kralen (van ongeveer 10 micrometer groot) in een oplossing drijven. De fase- en fluorescentie-informatie werden gegenereerd uit opnames met behulp van de voorgestelde methodologie. De kralen bewegen ook in de diepterichting, het is dus mogelijk om hun 3D-positie terug te vinden door de reconstructieafstand te wijzigen om ze scherp te houden.

In dit onderzoek, een multimodale digitale holografische microscoop ontwikkeld, geschikt voor gelijktijdige 3-D fase- en fluorescentiemetingen. Met de mogelijkheid om tegelijkertijd kwantitatieve fase- en fluorescentiebeeldvorming uit te voeren, er wordt aangenomen dat deze methode zal dienen als een nieuwe basistechnologie voor de visualisatie van levende biologische weefsels en cellen. Vooral, het is aangetoond dat deze microscoop kan worden toegepast op complexe plantencellen. Het kan worden gebruikt om een ​​gediversifieerd begrip te krijgen van het stamcelvormingsproces in planten, die zich gemakkelijker voortplanten dan dierlijke cellen. In de toekomst, het is wellicht mogelijk om deze informatie te gebruiken om het proces van stamcellen te sturen via stimulatie door licht. Efficiënte plantenreproductie en groei bereikt door de voorgestelde beeldvorming en toekomstige stimulatie zou kunnen worden toegepast op de ontwikkeling van een voedselkweeksysteem.

Deze technologie zou kunnen worden ontwikkeld door de efficiëntie van het lichtgebruik verder te verbeteren. Bij digitale holografie, het is noodzakelijk om de straaldiameter ruimtelijk te verbreden, splits het in tweeën, en laat ze dan weer overlappen om de interferentie tussen de twee lichtpaden te gebruiken. Daarom, het is ook nodig om de fluorescentie-energie te verhogen zodat deze door de beeldsensor kan worden waargenomen. Om dit te bereiken, er zou een grote hoeveelheid lichtenergie nodig zijn om de levende cellen te verlichten, echter, cellulaire schade veroorzaakt door het licht zou een groot probleem zijn. Er wordt gedacht dat een volumehologram zou kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van het lichtgebruik te verhogen en cellulaire fototoxiciteit te vermijden.

Een ander probleem is dat de gereconstrueerde 3D-verdeling zich uitstrekt tot in de voortplantingsrichting van het licht (de diepterichting van het object), afnemende axiale resolutie. De onderzoekers werken aan methoden met behulp van deep learning en filtering om deze uitbreiding in diepterichting te onderdrukken en de beeldkwaliteit te verbeteren.