Wetenschappers van de Universiteit van Würzburg hebben de huidige superresolutiemicroscopie kunnen verbeteren door een nieuwe aanpassing. Ze bedekten het glazen dekglaasje als onderdeel van de monsterdrager met op maat gemaakte biocompatibele nanosheets die een spiegeleffect creëren. Deze methode laat zien dat het lokaliseren van enkele emitters voor een metaal-diëlektrische coating leidt tot hogere precisie, helderheid en contrast in Single Molecule Localization Microscopy (SMLM). De studie werd gepubliceerd in de Natuur logboek Licht:wetenschap en toepassingen .

De scherpte van een lichtmicroscoop wordt beperkt door fysieke omstandigheden - structuren die dichter bij elkaar liggen dan 0,2 duizendste van een millimeter vervagen, en zijn niet meer van elkaar te onderscheiden. De oorzaak van deze vervaging is diffractie. Elk puntvormig object wordt dus niet als een punt weergegeven, maar als een wazige plek.

Met wiskundige methoden, de resolutie kan nog drastisch worden verbeterd. Eén methode zou het exacte midden ervan berekenen uit de helderheidsverdeling van de wazige plek. Echter, het werkt alleen als twee dicht bij elkaar liggende punten van het object aanvankelijk niet gelijktijdig maar vervolgens zichtbaar zijn, en worden later in de beeldverwerking samengevoegd. Deze tijdelijke ontkoppeling voorkomt superpositie van de wazige plek. Voor jaren, onderzoekers in de biowetenschappen hebben deze lastige methode gebruikt voor superhoge resolutie lichtmicroscopie van cellen.

Een dergelijke methode is ontwikkeld door de onderzoeksgroep van Prof. Dr. Markus Sauer aan de Universiteit van Würzburg:directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM). Deze krachtige SMLM-techniek kan een laterale resolutie van ~ 20 nm bieden. Voor dit doeleinde, bepaalde structuren, bijvoorbeeld, poriën van een celkern, zijn gekleurd met fluorescerende kleurstoffen. Elk van de kleurstofmoleculen knippert met onregelmatige tussenpozen en vertegenwoordigt een deel van de porie. Het beeld van de kernporiën is daarom in eerste instantie niet zichtbaar, maar ontstaat na de beeldverwerking door de superpositie van enkele duizenden beelden. Met de dSTORM-techniek, de resolutie van een conventionele lichtmicroscoop kan met een factor 10 worden verhoogd. "Het stelt ons in staat om de architectuur van een cel tot op moleculair niveau te visualiseren, bijvoorbeeld, ", legt Hannah Heil uit. De onderzoeker promoveert aan het Rudolf Virchow Center van de Universiteit van Würzburg in de groep van prof. Katrin Heinze.

Echter, de fotonstatistieken definiëren een virtuele resolutielimiet in resolutie. Om dit probleem aan te pakken, Katrin Heinze kwam op het idee om relatief eenvoudige biocompatibele nanocoatings te gebruiken om het signaal te versterken. In samenwerking met Markus Sauer en collega's van de faculteit Natuurkunde, Hannah Heil ontwierp en vervaardigde metaal-diëlektrische nanocoatings die zich gedragen als een afstembare spiegel. Het verdubbelt bijna de resolutie.

Spiegel, spiegel aan de wand:welk beeld is het scherpst van allemaal?

Tijdens de observatie, ze plaatsten de cellen op een opgedampt dekglaasje met een dunne reflecterende nanocoating bestaande uit zilver en transparant siliciumnitriet. De coating is biocompatibel, zodat het de cel niet beschadigt. Met deze methode, de twee groepen bereikten twee effecten:de spiegel weerkaatste het licht dat naar de microscoop werd uitgezonden, waardoor de helderheid van het fluorescentiesignaal en dus ook de effectieve beeldscherpte toenam.

Tweede, de uitgezonden en de gereflecteerde lichtgolven worden gesuperponeerd. Dit zorgt voor zogenaamde interferentie. Afhankelijk van de afstand tot de spiegel, het licht wordt versterkt of gedempt. "Op deze manier, we zien vooral structuren in een bepaald beeldvlak, "zegt Heil. "Alles wat boven of onder is en het beeld mogelijk kan verstoren, is, anderzijds, verborgen." Om ervoor te zorgen dat de exacte delen van de afbeelding zichtbaar worden, de dikte van de transparante laag die op de spiegel wordt aangebracht, moet op de juiste manier worden gekozen. Onder andere, Heinze en Heil gebruiken computersimulaties om de coating af te stemmen op het object.

Algemeen, de methode is verrassend eenvoudig te gebruiken, zegt Hannah Heil. "Dat vind ik zo leuk aan onze aanpak." Prof. Heinze voegt toe, "Behalve het goedkope met metaal-diëlektrische gecoate dekglaasje, is er geen extra microscoophardware of -software nodig om de lokalisatieprecisie te vergroten, en is dus een fantastische aanvulling op geavanceerde microscopie."