Een nieuwe techniek ontwikkeld door onderzoekers van het ARC Center of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CNBP) zal helpen om nieuw licht te werpen op biologische vraagstukken door de kwaliteit en kwantiteit van informatie die kan worden geëxtraheerd in fluorescentiemicroscopie te verbeteren.

De techniek, 'bleaching-assisted multichannel microscopy' (BAMM) neemt een huidige langdurige zwakte van fluorescentiemicroscopie - fotobleken - en verandert het in een sterkte die de beelduitvoer tot drie keer verbetert, zonder dat er extra hardware nodig is.

Gerapporteerd in het journaal Biomedische Optica Express , BAMM zal onderzoekers helpen om biologisch inzicht te krijgen in de ingewikkelde processen die plaatsvinden in levende cellen. Dit omvat de wisselwerking tussen eiwitten en moleculen die het potentieel hebben om een ​​breed scala aan gezondheidsgebieden te beïnvloeden, van vruchtbaarheid, pijnigen, tot hartaandoeningen en meer.

"Fluorescentiemicroscopie is een van de meest gebruikte technieken in de biologie. Dit is waar lichtemitterende moleculen, fluoroforen genaamd, zijn gebonden aan extreem kleine cellulaire doelen zoals eiwitten, genetisch materiaal of andere interessante biomoleculen, " zegt Dr. Antony Orth, CNBP Research Fellow aan RMIT University en hoofdauteur van het onderzoekspaper.

"Als de fluorofoor wordt geëxciteerd door licht van de microscoop, het reageert door een specifieke kleursignatuur uit te zenden. Als we die kleursignatuur onder de microscoop zien, kunnen we zien, volg en begrijp het cellulaire doelwit waaraan de fluorofoor is gebonden."

Met name zegt Dr. Orth, je kunt verschillende gekleurde fluoroforen hechten aan verschillende celdoelen, alles in één monster, om de ontvangen gegevens en beeldinformatie te maximaliseren.

Deze traditionele benadering van fluorescentiemicroscopie is veelzijdig, maar er is een grote beperking:het zichtbare (of kleuren) spectrum, waar de meeste fluoroforen werken, druk kan worden. In een ideaal experiment elk doel moet zo worden gekozen dat het een duidelijke kleuremissie heeft, maar dit wordt steeds moeilijker te regelen naarmate het aantal doelen toeneemt.

"Het zichtbare kleurenspectrum beslaat een bereik van 400 nanometer (nm) tot 700 nm en slechts ongeveer 200 nm van dit bereik is beschikbaar voor fluorescentiekleuremissie, " legt Dr. Orth uit.

"Een typische fluorofoor zendt uit over een bereik van 50 nm van het kleurenspectrum. Het verdelen van 200 nm van het zichtbare spectrum in segmenten van 50 nm betekent dat de kleuren van de fluorescerende emitters beginnen te versmelten wanneer je probeert om meer dan vier kleuren in te persen."

"Dit beperkt onderzoekers over het algemeen tot vier of minder fluorescerende doelen in een monster, " zegt dr. Orth.

"Typisch, de meeste experimenten zijn nog minder ambitieus, met slechts twee of drie doelen. De kern van het probleem is dat slechts één eigenschap van de fluorofoor - de kleur - wordt gebruikt voor identificatie."

Om deze beperking te helpen overwinnen, Dr. Orth en zijn mede-onderzoekers hebben een innovatieve techniek ontwikkeld die 'bleaching-assisted multichannel microscopy' (BAMM) wordt genoemd om hun beeldvormingsoutput te vergroten.

"In plaats van kleur te gebruiken om onderscheid te maken tussen fluoroforen, we gebruiken de vierde dimensie van tijd en exploiteren een fenomeen dat fotobleken wordt genoemd - het dimmen van een verzameling fluoroforen of pigmenten onder herhaalde blootstelling aan licht, " zegt dr. Orth.

"Omdat elk type fluorofoor met een andere snelheid bleekt, we kunnen onderscheid maken tussen fluoroforen zonder kleurinformatie te gebruiken. We gebruiken de snelheid van fotobleken als identificatie."

"In combinatie met traditionele kleurinformatie, deze toegevoegde dimensie van fotobleken stelt wetenschappers in staat 2-3 keer meer soorten fluorescerende moleculen te gebruiken, alles in één monster. Hierdoor kunnen we veel meer informatie uit één onderzoek halen."

"Onderzoekers zullen meer informatieve tests kunnen ontwerpen, bijvoorbeeld vijf doelen benadrukken terwijl er voorheen slechts twee praktisch waren. Ze hoeven niet langer het gebruik van twee fluoroforen met dezelfde kleur te vermijden, aangezien een verschil in fotostabiliteit alleen al voldoende is om onderscheid te maken tussen de twee doelen, " hij zegt.

traditioneel, het fenomeen van fotobleken (of vervaging) is schadelijk geweest voor het fluorescentiemicroscopieproces. Dit is waar hoge intensiteit en voortdurende verlichting van de microscoop permanent het vermogen van een fluorofoor om te fluoresceren vernietigt, zodat beeldvorming van het celdoel onmogelijk wordt.

"BAMM transformeert fotobleken van een al lang bestaande zwakte van fluorescentiemicroscopie in een significante sterkte om verhoogde identificatie van cellulaire doelen mogelijk te maken, " zegt dr. Orth.

"BAMM vereist geen extra hardware, het is relatief eenvoudig om te doen en vereist geen gespecialiseerde monstervoorbereiding. Het is een buitengewoon opwindende nieuwe benadering die alle gebruikers van fluorescentiemicroscopie en hun verkennende wetenschap ten goede kan komen, " hij zegt.

Onderzoekers die formeel betrokken waren bij het BAMM-project waren verbonden aan CNBP (RMIT University en de University of Adelaide) en Thermo Fisher Scientific.