Wat je ook doet, of het nu autorijden is, joggen of zelfs op je gemak, chips eten en tv kijken op de bank, er is een hele reeks moleculaire machines in elk van je cellen die hard aan het werk zijn. Die machine, veel te klein om met het blote oog of zelfs met veel microscopen te kunnen zien, creëert energie voor de cel, produceert zijn eiwitten, maakt kopieën van zijn DNA en nog veel meer.

Onder die machines, en een van de meest complexe, is iets dat bekend staat als het nucleaire poriecomplex (NPC). De NPC, die is gemaakt van meer dan 1.000 individuele eiwitten, is een ongelooflijk onderscheidende poortwachter voor de celkern, het membraangebonden gebied in een cel dat het genetische materiaal van die cel bevat. Alles wat de kern in of uit gaat, moet onderweg door de NPC gaan.

De rol van de NPC als poortwachter van de kern betekent dat het van vitaal belang is voor de werking van de cel. Binnen de kern wordt DNA, de permanente genetische code van de cel, gekopieerd naar RNA. Dat RNA wordt vervolgens uit de kern gedragen, zodat het kan worden gebruikt om de eiwitten te produceren die de cel nodig heeft. De NPC zorgt ervoor dat de kern de materialen krijgt die nodig zijn voor het synthetiseren van RNA, terwijl het ook het DNA beschermt tegen de ruwe omgeving buiten de kern en het RNA in staat stelt de kern te verlaten nadat het is gemaakt.

"Het is een beetje zoals een vliegtuighangar waar je 747's kunt repareren, en de deur gaat open om de 747 binnen te laten, maar er staat daar een persoon die kan voorkomen dat een enkele knikker eruit komt terwijl de deuren open zijn", zegt Caltech's André Hoelz, hoogleraar scheikunde en biochemie en een Faculty Scholar van het Howard Hughes Medical Institute. Al meer dan twee decennia bestudeert en ontcijfert Hoelz de structuur van de NPC in relatie tot zijn functie. In de loop der jaren heeft hij de geheimen ervan gestaag uitgewist en ze stuk voor stuk ontrafeld.

De implicaties van dit onderzoek zijn potentieel enorm. Het NPC staat niet alleen centraal in de werking van de cel, het is ook betrokken bij veel ziekten. Mutaties in de NPC zijn verantwoordelijk voor sommige ongeneeslijke kankers, voor neurodegeneratieve en auto-immuunziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS) en acute necrotiserende encefalopathie, en voor hartaandoeningen zoals atriale fibrillatie en vroege plotselinge hartdood. Bovendien richten veel virussen, waaronder degene die verantwoordelijk is voor COVID-19, zich op de NPC en sluiten deze af in de loop van hun levenscyclus.

Nu, in een paar artikelen gepubliceerd in het tijdschrift Science , Hoelz en zijn onderzoeksteam beschrijven twee belangrijke doorbraken:de bepaling van de structuur van het buitenoppervlak van de NPC en de opheldering van het mechanisme waarmee speciale eiwitten werken als een moleculaire lijm om de NPC bij elkaar te houden.

Een heel kleine 3D-puzzel

In hun paper getiteld "Architecture of the cytoplasmic face of the nucleaire porie", beschrijven Hoelz en zijn onderzoeksteam hoe ze de structuur van de zijkant van de NPC in kaart hebben gebracht die naar buiten gericht is vanuit de kern en in het cytoplasma van de cellen. Om dit te doen, moesten ze het equivalent van een zeer kleine 3D-puzzel oplossen, met behulp van beeldvormende technieken zoals elektronenmicroscopie en röntgenkristallografie op elk puzzelstukje.

Stefan Petrovic, een afgestudeerde student biochemie en moleculaire biofysica en een van de co-eerste auteurs van de artikelen, zegt dat het proces begon met Escherichia coli-bacteriën (een bacteriestam die vaak wordt gebruikt in laboratoria) die genetisch gemanipuleerd zijn om de eiwitten te produceren die verzin de menselijke NPC.

"Als je het lab binnenloopt, zie je deze gigantische muur van kolven waarin culturen groeien", zegt Petrovic. "We brengen elk afzonderlijk eiwit tot expressie in E. coli-cellen, breken die cellen open en zuiveren chemisch elk eiwitbestanddeel."

Toen die zuivering, waarvoor wel 1500 liter bacteriecultuur nodig was om genoeg materiaal voor een enkel experiment te krijgen, was voltooid, begon het onderzoeksteam nauwgezet te testen hoe de delen van de NPC in elkaar passen.

George Mobbs, een senior postdoctoraal wetenschappelijk onderzoeker in scheikunde en een andere co-eerste auteur van het artikel, zegt dat de vergadering op een "stapsgewijze" manier plaatsvond; in plaats van alle eiwitten tegelijkertijd in een reageerbuis te gieten, testten de onderzoekers paren eiwitten om te zien welke in elkaar zouden passen, als twee puzzelstukjes. Als er een paar werd gevonden dat bij elkaar past, zouden de onderzoekers de twee nu gecombineerde eiwitten testen tegen een derde eiwit totdat ze er een vonden die bij dat paar past, en dan werd de resulterende driedelige structuur getest tegen andere eiwitten, en dus Aan. Door zich op deze manier een weg door de eiwitten te banen, werd uiteindelijk het eindresultaat van hun paper verkregen:een wig van 16 eiwitten die acht keer wordt herhaald, zoals plakjes van een pizza, om het gezicht van de NPC te vormen.

"We rapporteerden de eerste volledige structuur van het gehele cytoplasmatische gezicht van de menselijke NPC, samen met rigoureuze validatie, in plaats van een reeks incrementele vooruitgang van fragmenten of delen te rapporteren op basis van gedeeltelijke, onvolledige of lage resolutie observatie", zegt Si Nie. , postdoctoraal wetenschappelijk onderzoeksmedewerker in de chemie en ook een co-eerste auteur van het artikel. "We besloten geduldig te wachten tot we alle benodigde gegevens hadden verzameld en rapporteerden een gigantische hoeveelheid nieuwe informatie."

Hun werk was een aanvulling op het onderzoek van Martin Beck van het Max Planck Instituut voor Biofysica in Frankfurt, Duitsland, wiens team cryo-elektronentomografie gebruikte om een ​​kaart te genereren die de contouren van een puzzel opleverde waarin de onderzoekers de stukjes moesten plaatsen. Om de voltooiing van de puzzel van de menselijke NPC-structuur te versnellen, hebben Hoelz en Beck meer dan twee jaar geleden gegevens uitgewisseld en vervolgens onafhankelijk structuren van de gehele NPC gebouwd. "De aanzienlijk verbeterde Beck-kaart liet veel duidelijker zien waar elk stuk van de NPC - waarvoor we de atomaire structuren hebben bepaald - moest worden geplaatst, vergelijkbaar met een houten frame dat de rand van een puzzel definieert", zegt Hoelz.

De experimenteel bepaalde structuren van de NPC-stukken van de Hoelz-groep dienden om de modellering door de Beck-groep te valideren. "We hebben de structuren onafhankelijk van elkaar op de kaart gezet, met verschillende benaderingen, maar de uiteindelijke resultaten kwamen volledig overeen. Het was zeer bevredigend om dat te zien", zegt Petrovic.

"We hebben een raamwerk gebouwd waarop nu veel experimenten kunnen worden gedaan", zegt Christopher Bley, een senior postdoctoraal wetenschappelijk onderzoeker in de chemie en tevens co-eerste auteur. "We hebben nu deze samengestelde structuur en het maakt toekomstige experimenten met NPC-functie of zelfs ziekten mogelijk en informeert. Er zijn veel mutaties in de NPC die worden geassocieerd met vreselijke ziekten, en we weten waar ze zich in de structuur bevinden en hoe ze komen samen kan helpen bij het ontwerpen van de volgende reeks experimenten om te proberen de vragen te beantwoorden over wat deze mutaties doen."

'Dit elegante arrangement van spaghettinoedels'

In het andere artikel, getiteld "Architecture of the linker-scaffold in the nucleaire porie", beschrijft het onderzoeksteam hoe het de hele structuur heeft bepaald van wat bekend staat als de linker-scaffold van de NPC - de verzameling eiwitten die helpen de NPC bij elkaar te houden terwijl het het ook de flexibiliteit geeft die het nodig heeft om te openen en te sluiten en om zichzelf aan te passen aan de moleculen die er doorheen gaan.

Hoelz vergelijkt de NPC met iets dat is opgebouwd uit Legoblokjes die in elkaar passen zonder aan elkaar te klikken en in plaats daarvan aan elkaar worden vastgemaakt door elastiekjes die ze grotendeels op hun plaats houden terwijl ze toch een beetje kunnen bewegen.

"Ik noem deze ongestructureerde lijmstukken de 'donkere materie van de porie'", zegt Hoelz. "Deze elegante opstelling van spaghettinoedels houdt alles bij elkaar."

Het proces voor het karakteriseren van de structuur van de linker-steiger was vrijwel hetzelfde als het proces dat werd gebruikt om de andere delen van de NPC te karakteriseren. Het team vervaardigde en zuiverde grote hoeveelheden van de vele soorten linker- en scaffold-eiwitten, gebruikte een verscheidenheid aan biochemische experimenten en beeldvormingstechnieken om individuele interacties te onderzoeken, en testte ze stuk voor stuk om te zien hoe ze bij elkaar passen in de intacte NPC.

Om hun werk te controleren, introduceerden ze mutaties in de genen die coderen voor elk van die linker-eiwitten in een levende cel. Omdat ze wisten hoe die mutaties de chemische eigenschappen en vorm van een specifiek linker-eiwit zouden veranderen, waardoor het defect zou worden, konden ze voorspellen wat er zou gebeuren met de structuur van de NPC's van de cel wanneer die defecte eiwitten werden geïntroduceerd. Als de NPC's van de cel functioneel en structureel defect waren zoals ze verwachtten, wisten ze dat ze de juiste rangschikking van de linker-eiwitten hadden.

"Een cel is veel gecompliceerder dan het eenvoudige systeem dat we in een reageerbuis maken, dus het is noodzakelijk om te verifiëren dat de resultaten van in vitro-experimenten in vivo standhouden", zegt Petrovic.

De assemblage van het buitenoppervlak van de NPC hielp ook bij het oplossen van een lang mysterie over de nucleaire envelop, het dubbele membraansysteem dat de kern omringt. Net als het membraan van de cel waarin de kern zich bevindt, is het kernmembraan niet perfect glad. Het is eerder bezaaid met moleculen die integrale membraaneiwitten (IMP's) worden genoemd en die verschillende rollen vervullen, waaronder het optreden als receptoren en het helpen katalyseren van biochemische reacties.

Hoewel IMP's zowel aan de binnen- als buitenkant van de nucleaire enveloppe te vinden zijn, was het onduidelijk hoe ze daadwerkelijk van de ene naar de andere kant reisden. Omdat IMP's in het membraan vastzitten, kunnen ze niet zomaar door het centrale transportkanaal van de NPC glijden, zoals vrij zwevende moleculen.

Toen het team van Hoelz eenmaal de structuur van de linker-steiger van de NPC begreep, realiseerden ze zich dat het de vorming van kleine "goten" rond de buitenrand mogelijk maakt, waardoor de IMP's langs de NPC van de ene kant van de nucleaire envelop naar de andere kunnen glippen, terwijl blijft altijd ingebed in het membraan zelf.

"Het verklaart veel dingen die in het veld raadselachtig waren. Ik ben erg blij om te zien dat het centrale transportkanaal inderdaad het vermogen heeft om uit te zetten en laterale poorten te vormen voor deze IMP's, zoals we oorspronkelijk meer dan tien jaar geleden hadden voorgesteld ', zegt Hoelz.

Alles bij elkaar genomen vertegenwoordigen de bevindingen van de twee artikelen een sprong voorwaarts in het begrip van wetenschappers over hoe de menselijke NPC is gebouwd en hoe deze werkt. De ontdekkingen van het team openen de deur voor veel meer onderzoek. "Na de structuur te hebben bepaald, kunnen we ons nu concentreren op het uitwerken van de moleculaire basen voor de functies van de NPC, zoals hoe mRNA wordt geëxporteerd en de onderliggende oorzaken voor de vele NPC-geassocieerde ziekten met als doel het ontwikkelen van nieuwe therapieën", zegt Hoelz.

De artikelen die het werk beschrijven, verschijnen in het nummer van 10 juni van het tijdschrift Science . + Verder verkennen

Biochemici lossen de structuur van de DNA-poortwachter van de cel op