Een onderzoeksteam onder leiding van Prof. Wang Junfeng van de Hefei Institutes of Physical Science (HFIPS) van de Chinese Academy of Sciences (CAS) heeft een nieuwe eendimensionale (1D) fluor-19 ( ¹⁹ F) op kernmagnetische resonantie (NMR) gebaseerde methode voor snelle detectie van Arf6-guanine-nucleotide-uitwisselingsfactor (GEF)-activiteit.

Hun resultaten zijn gepubliceerd in Analytical Chemistry op 6 juni

Kleine GTPases (sGTPase) zijn betrokken bij signaalcascades die een breed scala aan cellulaire reacties regelen. Alle sGTPases kunnen in twee toestanden worden gevonden:een inactieve toestand waarin het kleine GTPase is gebonden aan Guanosinedifosfaat (GDP), en een actieve toestand waarin het is gebonden aan Guanosinetrifosfaat (GTP). De GTPase-cyclus gevormd door de onderlinge omzetting tussen de twee toestanden wordt strikt gereguleerd door guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren (GEF's) en GTPase-activerende eiwitten (GAP's).

Mutatie of abnormale regulatie van sGTPase-eiwitten of hun respectievelijke GEF's/GAP's zijn nauw verwant aan vele ziekten, waaronder kanker. Daarom is het belangrijk om de activiteit van deze GEF/GAP-eiwitten zowel in vitro als in vivo te detecteren.

In deze studie hebben de onderzoekers het onnatuurlijke aminozuur tfmF plaatsspecifiek opgenomen in Phe47 van sGTPase Arf6, een positie in het ARF6-schakeldomein waarvan de conformatie het meest verandert tijdens de GTPase-cyclus. En ze ontwikkelden de 1D ¹⁹ F NMR-gebaseerde methode om GEF-activiteit te detecteren in gezuiverd eiwitsysteem of in aanwezigheid van cellysaten.

Voor een GEF-activiteitstest werd het monster van GDP-geladen Arf6-F47 tfmF zo snel mogelijk in de spectrometer geplaatst na toevoeging van een GEF en GTP. Een opeenvolgende reeks van 1D ¹⁹ F NMR-spectra werden verzameld. Het signaal van Arf6-F47 tfmF in de GTP-gebonden toestand werd verwerkt en geïntegreerd. De kinetische uitwisselingscurven werden vervolgens uitgezet en aangepast aan een eenfasige exponentiële groeicurve om de snelheid te extraheren.

"Deze strategie kan mogelijk worden gebruikt om conformationele verandering van Arf6 of andere sGTPase te volgen," zei Wu Bo, eerste auteur van de studie, "het kan de activiteiten van regulerende sGTPase-eiwitten in fysiologische en pathologische omgevingen detecteren." + Verder verkennen

Onderzoekers lokaliseren mechanisme dat het verkeer van celeiwitten controleert