Wanneer u werkt met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), is een goede kalibratie absoluut noodzakelijk om betrouwbare resultaten van hoge kwaliteit te garanderen. Een juiste kalibratie van een HPLC-instrument begint met het maken van een geschikte kalibratiestandaard. In de meeste gevallen vereist kalibratie in feite een reeks standaarden voor toenemende concentratie om een ​​zogeheten ijkcurve te produceren. Dit is een geplotte lijn en bijbehorende vergelijking die de relatie beschrijft tussen de concentratie van de te testen stof en de respons van de HPLC-detector.

Bepaal de chemische stof die u wilt testen voor gebruik van de HPLC (de " analyt "). U zou bijvoorbeeld een reeks frisdranken willen testen op fructose-inhoud, in welk geval fructose de analyt zou zijn.

Verkrijg een hoeveelheid van de analyt-chemische stof met een geschikte zuiverheid. Normaal gesproken zou de zuiverheid meer dan 99% moeten zijn en de analyt moet worden gekocht bij een gerenommeerd chemiebedrijf. In het geval van fructose, bijvoorbeeld, zou je pure fructose kopen bij een chemische verkoper en niet bij een supermarkt.

Bepaal de maximale en minimaal verwachte concentraties van de analyt in de monsters die je wilt testen op de HPLC. In het geval van frisdranken onderzoekt u de etiketten van de dranken en bepaalt u het laagste en hoogste fructosegehalte van de dranken die u gaat testen. Houd er rekening mee dat het eerste monster (de frisdrank) kan worden verdund of anderszins gemanipuleerd tijdens de voorbereiding voor analyse (afhankelijk van de HPLC-methode die wordt gebruikt) en dus kan de analytconcentratie in de monsters die daadwerkelijk in de HPLC zijn geïnjecteerd, worden gewijzigd. Het is de analytconcentratie in de monsters op de HPLC die moet worden overwogen.

Bepaal het oplosmiddel waarin u uw analyt oplost om de kalibratienormen op te maken. Dit oplosmiddel moet in staat zijn om de analyt goed op te lossen in een relatief breed concentratiegebied (minstens zo hoog als in de monsters die u wilt testen). Ook zou dit oplosmiddel idealiter redelijk vergelijkbaar moeten zijn met de "mobiele fase:" het oplosmiddel dat wordt gebruikt om monsters door het HPLC-instrument te voeren.

Bereken de hoeveelheid analyt die nodig is om een ​​"standaardoplossing" -oplossing van de analyt. Dit wordt gevonden door de vereiste concentratie van de voorraadstandaard te vermenigvuldigen met het gewenste volume. De concentratie van de analyt in deze oplossing moet ten minste 10% hoger zijn dan de hoogste verwachte monsterconcentratie. Als de hoogste verwachte fructoseconcentratie in een frisdrankmonster 8 g /100 milliliter is, kan de standaard worden gemaakt tot een concentratie van 10 g fructose /100 milliliter. Een redelijk volume is 500 milliliter, dus 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fructose is vereist.

Weeg de benodigde hoeveelheid analyt af tot een geschikt niveau van precisie. Vaak is een gewichtswaarde in gram nauwkeurig tot op een of twee decimalen geschikt, maar voor sommige methoden kan meer precisie nodig zijn.

Breng de gewogen analyt over in een maatkolf van het benodigde volume en voeg het gewenste oplosmiddel toe aan de vulling op de kolf. Het gebruik van een maatkolf (in plaats van een maatbeker bijvoorbeeld) verhoogt de nauwkeurigheid van de standaardstandsconcentratiewaarde. Zorg ervoor dat alle analyt naar de kolf is overgebracht; gebruik een deel van het oplosmiddel om het in te wassen, indien nodig.

Stop de maatkolf en schud zachtjes of inverteren totdat de analyt volledig is opgelost.

Maak een reeks verschillende verdunningen van de voorraad standaard door bekende volumina van de stamstandaard in volumetrische kolven over te brengen, pipetten te gebruiken voor een nauwkeurige overdracht en vervolgens oplosmiddel toe te voegen. De laagste standaardconcentratie moet lager zijn dan de laagst te verwachten steekproef die moet worden geanalyseerd. In het frisdrankvoorbeeld, als de laagste verwachte fructoseconcentratie in een monster 2 gram /100 ml is, zou een standaard van 1 gram /100 ml kunnen worden gemaakt. Dit zou worden gedaan door een tienvoudige verdunning van de standaard. De standaardserie moet in totaal 5 of 6 concentraties bevatten, dus extra verdunningen om standaarden van misschien 3, 5 en 8 gram fructose /ml te produceren zijn vereist. U hebt nu een reeks standaardoplossingen waarmee u de HPLC kunt kalibreren.

Tip

Het is mogelijk om kalibratiestandaarden te maken die meer dan één analyt bevatten, indien nodig. Het is vaak een goede gewoonte om kalibratiemonsters (en -normen) te filteren voordat u ze in de HPLC injecteert om fijne deeltjes te verwijderen die het instrument zouden kunnen verstoppen.

Waarschuwing

Sommige standaarden degraderen snel nadat ze zijn verwijderd gemaakt. Zorg ervoor dat uw normen regelmatig worden vervangen als dit het geval is. Zoals met alle chemische procedures, moet u de juiste voorzorgsmaatregelen in acht nemen bij het werken met mogelijk schadelijke analyten of oplosmiddelen zoals die welke toxisch of ontvlambaar zijn.