Door Marcia Spear
Bijgewerkt op 24 maart 2022

NikiLitov/iStock/GettyImages

De Gram-kleuring is een fundamentele microbiologische techniek die Gram-positieve van Gram-negatieve bacteriën onderscheidt op basis van hun celwandstructuur en de resulterende kleur. Acetonalcohol speelt een cruciale rol als ontkleuringsmiddel, waardoor de uiteindelijke kleurdifferentiatie de bacteriële identiteit kan onthullen.

Primaire beits – Kristalviolet

Na het maken van een bacterieuitstrijkje wordt gedurende 30 seconden kristalviolet aangebracht. In dit stadium zien zowel Gram-positieve als Gram-negatieve cellen er uniform paars uit. Een korte wasbeurt met water verwijdert overtollige kleurstof, hoewel er wat kristalviolet aan de dikke peptidoglycaanlagen van Gram-positieve cellen gebonden blijft.

Bijtmiddel – Jodium

Jodium wordt gedurende één minuut toegevoegd en functioneert als een bijtmiddel dat zich bindt aan kristalviolet en een onoplosbaar kristalviolet-jodiumcomplex vormt. Dit complex hecht zich sterk aan het robuuste peptidoglycan van Gram-positieve bacteriën, waardoor de primaire vlek wordt vastgehouden zonder dat er vervolgens met water hoeft te worden gespoeld.

Ontkleuringsmiddel – Acetonalcohol

Aceton of ethylalcohol wordt gedurende 10-20 seconden gebruikt om het kristalviolet-jodiumcomplex uit gramnegatieve cellen te verwijderen. De alcohol lost het buitenste lipidemembraan op, waardoor de kleurstof uit de dunnere peptidoglycaanlaag kan ontsnappen. Nadat de afvoer kleurloos is, stopt een spoeling met water de ontkleurende werking. Gram-positieve cellen behouden de paarse kleur, terwijl Gram-negatieve cellen kleurloos worden.

Tegenkleuring – Safranine

Safranine wordt gedurende ongeveer één minuut aangebracht om contrast te creëren, waardoor de nu kleurloze Gram-negatieve bacteriën roze kleuren. Het donkerdere kristalviolette masker zorgt ervoor dat Gram-positieve cellen paars blijven. Een laatste waterspoeling verwijdert overtollige safranine.

Referenties

• Handleiding Microbiologisch Lab TCCD Zuidcampus; Barry Chess et al., 2009