SolStock/E+/GettyImages

Celmembranen zijn samengesteld uit fosfolipidedubbellagen met ingebedde eiwitten die essentiële cellulaire functies bemiddelen. Traditionele lichtmicroscopie kan geen individuele membraaneiwitten opsporen. Vriesbreuk, gecombineerd met elektronenmicroscopie, stelt ons in staat bevroren membranen langs hun dubbellaag te splitsen, waardoor de eiwitverdeling binnen de lipidematrix bloot komt te liggen. Door aanvullende labelingstechnieken te integreren, kunnen onderzoekers specifieke eiwitten, evenals bacteriële en virale componenten, met subnanometerprecisie in kaart brengen.

Basisstappen bij bevriezingsfracturen

1. Bevries cellen of weefsels snel in vloeibare stikstof om structuren te immobiliseren.

2. Gebruik een microtoom om het bevroren monster te breken; het membraan splitst tussen de twee fosfolipideblaadjes waar de hydrofobe interacties het zwakst zijn.

3. Voer vriesetsen uit in hoog vacuüm om ijskristallen te verwijderen, waarbij fijne details behouden blijven.

4. Schaduw het breukvlak af met een dunne film van koolstof en platina om een stabiele replica te creëren die de membraantopologie volgt.

5. Verteer resterend organisch materiaal met zuur, waardoor een platina omhulsel achterblijft dat het blootgestelde membraanoppervlak vertegenwoordigt.

6. Onderzoek de replica met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voor structurele analyse.

Etsen bevriezen

Door middel van bevriezen worden ijskristallen verwijderd die anders de membraandetails zouden verbergen. Het vacuümdroogproces behoudt de oorspronkelijke architectuur en maakt observatie van dynamische membraanactiviteiten, intracellulaire organellen en virale assemblages mogelijk.

Elektronenmicroscopie

Transmissie-elektronenmicroscopie biedt een vergroting tot een miljoen keer en resoluties tot 3 nm, waardoor het de voorkeursmodaliteit is voor replica's van vriesbreuken. Rasterelektronenmicroscopie (SEM) wordt in deze context minder vaak gebruikt, maar kan oppervlaktetopologie van grotere exemplaren opleveren.

Onthullende celmembraanstructuur

Sinds de introductie ervan ruim vijftig jaar geleden heeft vriesbreuk-TEM een belangrijke rol gespeeld bij het bevestigen van het lipidedubbellaagmodel van het plasmamembraan en het ophelderen van de ruimtelijke ordening van integrale, perifere en lipide-verankerde eiwitten. De techniek laat zien of eiwitten ‘floaters’ zijn die binnen de dubbellaag drijven of ‘ankers’ die beide blaadjes omspannen, en kan eiwitaggregatie of clustering detecteren. In combinatie met immunogold-labeling (antilichamen die zijn getagd met elektronendichte deeltjes) kunnen onderzoekers specifieke eiwitten identificeren en hun functionele rol afleiden.