Gel-elektroforese blijft een hoeksteentechniek in de moleculaire biologie, waardoor onderzoekers DNA-fragmenten op grootte kunnen scheiden en kosten kunnen in rekening brengen voor toepassingen zoals DNA-fingerprinting, restrictiekartering en sequencing.

Omdat DNA zelf kleurloos is, voegen wetenschappers trackingkleurstoffen (blauwe of oranje pigmenten) aan het monster toe. Deze kleurstoffen migreren samen met het DNA en bieden een visuele referentie waarmee de gebruiker de voortgang kan meten en een nauwkeurige bandidentificatie kan garanderen.

Hoe gelelektroforese werkt

Bij deze methode wordt een plak agarosegel gebruikt – een polysacharide afgeleid van zeewier – wordt bereid door agarosepoeder te mengen met een buffer die water en zout bevat. Het mengsel wordt verwarmd totdat de agarose oplost, en vervolgens afgekoeld om een ​​poreuze matrix te vormen. De gel wordt in een elektroforesekamer geplaatst en bedekt met geleidende buffer.

DNA-monsters, gecombineerd met een laadkleurstof, worden in putjes aan het negatieve (-) uiteinde van de gel geladen. Aan de andere kant bevindt zich een positieve (+) elektrode. De negatief geladen fosfaatruggengraat van DNA drijft de fragmenten naar de positieve elektrode wanneer het elektrische veld wordt aangelegd.

Kleinere fragmenten ondervinden minder weerstand en reizen sneller, waardoor verschillende banden ontstaan die overeenkomen met de fragmentgrootte.

Doel en belang van kleurstof laden

Het laden van kleurstoffen heeft twee primaire functies:ze verhogen de dichtheid van het monster zodat het in de put zinkt, en ze bieden een visueel signaal dat de migratie van DNA volgt. Veel voorkomende kleurstoffen zijn broomfenolblauw (optimaal voor fragmenten rond 400 bp) en xyleencyanol (beter geschikt voor fragmenten van 2–8 kbp). De kleurstof is zo gekozen dat deze niet reageert met het DNA of het verandert. Onderzoekers gebruiken doorgaans 5 µl laadkleurstof per 1 µl DNA-monster, volgens de richtlijnen van NEB en Thermo Fisher.

De rol van glycerol bij agarosegelelektroforese

Glycerol wordt aan het monster toegevoegd om de dichtheid te verhogen. Zonder glycerol zou het vloeibare monster zich over het geloppervlak verspreiden in plaats van zich netjes in de put te nestelen, waardoor de vorming van heldere, duidelijke banden in gevaar zou komen.

Trackingkleurstof in SDS‑PAGE

Voor eiwitscheiding vervangt natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) agarose. Broomfenolblauw wordt routinematig in de monsterbuffer opgenomen; het beweegt zich in hetzelfde tempo voort als de voorrand van de eiwitbanden en biedt een realtime visuele indicator van de voortgang.

Rol van DNA-bindende kleurstof

Na elektroforese worden DNA-bindende kleurstoffen gebruikt, zoals ethidiumbromide worden toegepast. Ethidiumbromide intercaleert tussen DNA-basen en fluoresceert helder onder ultraviolet licht, waardoor banden zichtbaar worden. Omdat het mutageen is, zijn strikte veiligheidsmaatregelen vereist bij het hanteren en weggooien van de kleurstof.