fotoquique/iStock/GettyImages

Moleculair klonen is een fundamentele techniek in de moderne biologie die elke student en onderzoeker zou moeten beheersen. Door restrictie-enzymen te gebruiken, knippen wetenschappers dubbelstrengig DNA in hanteerbare fragmenten die vervolgens in een plasmidevector kunnen worden ingebracht en tot expressie kunnen worden gebracht in een bacteriële gastheer.

Hoe restrictie-enzymen DNA herkennen

Restrictie-enzymen zijn endonucleasen die specifieke korte DNA-sequenties binden, restrictieplaatsen genoemd, en de fosfodiëster-skelet precies op die posities splitsen. Er zijn meer dan 90 verschillende enzymen gecatalogiseerd, elk van hen richt zich op een unieke sequentie en snijdt zijn site tot 5000 keer sneller door dan welke niet-herkende sequentie dan ook.

Kleverige uiteinden versus stompe uiteinden

Wanneer een restrictie-enzym snijdt, kunnen de resulterende uiteinden plakkerige uiteinden zijn of stompe uiteinden . Kleverige uiteinden bevatten enkelstrengige overhangen die complementair zijn aan elkaar; deze ‘plakkerigheid’ zorgt voor een snelle en specifieke koppeling tussen twee fragmenten. Stompe uiteinden hebben daarentegen perfect gepaarde strengen zonder overhangen, waardoor ze minder selectief zijn tijdens het afbinden.

Omdat kleverige uiteinden alleen paren met hun complementaire uitsteeksels, kan het ingevoegde fragment het plasmide binnenkomen in een enkele, gedefinieerde oriëntatie. Stompe uiteinden bieden geen dergelijke richtingscontrole, waardoor het fragment zowel kop-staart- als staart-kop-oriëntatie kan afbinden.

Waarom kleverige uiteinden belangrijk zijn bij ligatie

Hoewel zowel kleverige als stompe uiteinden uiteindelijk DNA-ligase nodig hebben om een continue streng te vormen, verminderen kleverige uiteinden de hoeveelheid DNA die nodig is voor een succesvolle reactie. Hun complementaire overhangen vinden elkaar sneller en efficiënter, waardoor ligatie kan plaatsvinden met lagere concentraties insert en vector.

Daarentegen zijn stompe uiteinden uitsluitend afhankelijk van de concentratie van DNA-moleculen om te botsen en uit te lijnen, wat vaak hogere inputhoeveelheden vereist om vergelijkbare ligatie-efficiënties te bereiken.

Meerdere enzymen, één overhang

Een van de krachtigste kenmerken van sticky-end-enzymen is dat verschillende enzymen identieke overhangs kunnen genereren, ook al herkennen ze verschillende sequenties. Bijvoorbeeld BamHI , BglII , en Sau3A ze produceren allemaal dezelfde kleverige overhang van 5’-GATC-3’. Deze redundantie vergroot de kans dat een paar geschikte locaties een gen van belang flankeren, waardoor onderzoekers flexibiliteit krijgen bij het kiezen van de optimale beperkingsstrategie.

Gemanipuleerde plasmiden kunnen ook restrictieplaatsen naast elkaar plaatsen, waardoor de veelzijdigheid van kloonontwerpen verder wordt vergroot.