Het kweken van anorganische functionele nanomaterialen, zoals kwantumstippen, direct in de kern van levende cellen, biedt onderzoekers ongekende mogelijkheden voor het bestuderen van cellulaire processen, het manipuleren van genexpressie en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën. Quantum dots zijn halfgeleider nanokristallen die door kwantumeffecten unieke optische en elektronische eigenschappen vertonen. Deze tutorial biedt een stapsgewijs protocol voor de synthese van kwantumdots in de kern van levende zoogdiercellen.

Materialen:

- Van belang zijnde zoogdiercellijn (bijv. HeLa, COS-7)

- Celkweekmedium (bijvoorbeeld Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)

- Foetaal runderserum (FBS)

- Penicilline-Streptomycine-antibioticumoplossing

- Quantum dot-voorlopermaterialen (bijv. cadmiumselenide (CdSe) of cadmiumtelluride (CdTe) zouten)

- Natriumboorhydride (NaBH4)

- L-ascorbinezuur

- Polyethyleenimine (PEI)

- Nucleair lokalisatiesignaal (NLS) peptide

- Transfectiereagens (bijv. Lipofectamine 2000)

Procedure:

1. Celcultuur:

- Behoud de zoogdiercellijn van interesse in een celkweekmedium aangevuld met FBS en penicilline-streptomycine-antibioticumoplossing.

- Plaats de cellen op glazen dekglaasjes of in kweekschalen voor microscopie en andere analyses.

2. Synthese van Quantum Dot-voorlopers:

- Bereid een voorraadoplossing van het quantum dot-precursormateriaal (bijvoorbeeld CdSe- of CdTe-zouten) in een geschikt oplosmiddel (bijvoorbeeld chloroform of dimethylformamide).

- Voor CdSe-kwantumstippen:los het CdSe-zout op in trioctylfosfine (TOP) en voeg trioctylfosfineoxide (TOPO) toe als stabilisator.

- Voor CdTe-kwantumstippen:los het CdTe-zout op in TOP en voeg telluriumpoeder en TOPO toe.

3. Nucleus-gerichte peptideconjugatie:

- Conjugeer de quantum dot-voorloperoplossing met het NLS-peptide om nucleaire lokalisatie te garanderen.

- Meng het NLS-peptide met de quantum dot-voorloperoplossing en roer gedurende enkele uren of een nacht.

- Zuiver de NLS-geconjugeerde quantum dot-voorloperoplossing met behulp van centrifugatie of membraanfiltratie.

4. Quantum Dot-synthese in cellen:

- Transfecteer de cellen met de NLS-geconjugeerde quantum dot precursor-oplossing met behulp van een geschikt transfectiereagens (bijv. Lipofectamine 2000).

- Volg de instructies van de fabrikant voor het transfectieprotocol.

- Incubeer de cellen gedurende voldoende tijd (bijvoorbeeld 24-48 uur) om quantum dot-synthese in de kern mogelijk te maken.

5. Reductie en stabilisatie:

- Behandel de cellen na incubatie met een reductiemiddel (bijvoorbeeld NaBH4) en een stabilisatiemiddel (bijvoorbeeld L-ascorbinezuur) om de quantum dot-voorlopers te verminderen en hun stabiliteit te verbeteren.

- Bereid een verse oplossing van NaBH4 en L-ascorbinezuur in celkweekmedium.

- Voeg de reductie- en stabilisatiemiddeloplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende een korte tijd (bijvoorbeeld 1-2 uur).

6. Beeldvorming en analyse:

- Gebruik fluorescentiemicroscopie om de kwantumdots te visualiseren die in de kern van levende cellen zijn gegroeid.

- Confocale microscopie of beeldvormingstechnieken met superresolutie kunnen gedetailleerde informatie verschaffen over de lokalisatie en morfologie van de kwantumdots.

- Analyseer de optische eigenschappen van de quantum dots, zoals emissiespectra, intensiteit en fotostabiliteit, om hun functionaliteit en geschiktheid voor specifieke toepassingen te beoordelen.

Aanvullende overwegingen:

- De keuze van quantum dots-voorlopermaterialen en de omstandigheden voor synthese kunnen de grootte, vorm en samenstelling van de quantum dots die in de cellen worden gevormd beïnvloeden.

- Optimalisatie van de transfectie- en syntheseomstandigheden kan nodig zijn om efficiënte nucleaire lokalisatie en kwantumdotvorming te bereiken.

- Passende controles, zoals cellen behandeld met niet-geconjugeerde quantum dot-voorlopers of cellen zonder transfectie, moeten worden opgenomen om een ​​nauwkeurige interpretatie van de resultaten te garanderen.

Door dit protocol te volgen kunnen onderzoekers met succes quantum dots direct in de kern van levende cellen laten groeien, waardoor de verkenning van nieuwe mogelijkheden op het gebied van bioimaging op nanoschaal, cellulaire nano-engineering en nanogeneeskunde mogelijk wordt.