In een nieuwe Natuurcommunicatie In deze studie hebben onderzoekers de constructie van genetische circuits op afzonderlijke DNA-moleculen onderzocht, waarbij gelokaliseerde eiwitsynthese is aangetoond als leidend principe voor dissipatieve nano-apparaten, wat inzicht biedt in kunstmatig celontwerp en toepassingen van nanobiotechnologie.

De term 'genetisch circuit' is een metaforische beschrijving van het complexe netwerk van genetische elementen (zoals genen, promoters en regulerende eiwitten) binnen een cel die op elkaar inwerken om genexpressie en cellulaire functies te controleren.

Op het gebied van kunstmatig celontwerp streven wetenschappers ernaar deze genetische circuits te repliceren en te manipuleren om functionele, op zichzelf staande eenheden te creëren. Deze circuits fungeren als de moleculaire machinerie die verantwoordelijk is voor het orkestreren van cellulaire processen door de productie van eiwitten en andere moleculen nauwkeurig te reguleren.

Door deze circuits te begrijpen en te manipuleren, kunnen onderzoekers kunstmatige cellen ontwikkelen met programmeerbaar gedrag, waarbij de functionaliteiten van natuurlijke cellen worden nagebootst.

In de context van het genoemde onderzoek ligt de nadruk op het construeren van genetische circuits op afzonderlijke DNA-moleculen. Dit vertegenwoordigt een nieuwe benadering die zich losmaakt van de traditionele cellulaire context en de mogelijkheid onderzoekt om genetische circuits te creëren in celvrije omstandigheden.

Eerste auteur Dr. Ferdinand Greiss van het Weizmann Institute of Science in Israël legde de motivatie van de onderzoekers uit aan Phys.org:"We proberen biologische processen te reconstrueren buiten het complexe circuit van levende cellen, waardoor we hopelijk ons ​​begrip van de leidende principes van de natuur kunnen verbeteren. onderzoek is gericht op de constructie van toekomstige kunstmatige cellen, en afzonderlijke DNA-moleculen zouden hiervoor de genetische basis kunnen vormen."

Genregulatie

Genregulatie is het proces waarbij cellen de expressie van genen controleren, waarbij wordt bepaald wanneer en in welke mate de informatie van een gen wordt gebruikt bij de synthese van functionele moleculen zoals eiwitten of RNA. Het speelt een cruciale rol bij het in stand houden van cellulaire functies, het reageren op veranderingen in het milieu en het garanderen van een goede ontwikkeling.

De regulatie van genexpressie omvat transcriptie en translatie. Tijdens transcriptie dient een specifiek DNA-segment als sjabloon voor de synthese van complementaire mRNA-moleculen door RNA-polymerase. Dit mRNA draagt ​​de genetische code van de kern naar het cytoplasma, waar translatie plaatsvindt.

Translatie omvat de omzetting van mRNA in eiwitten. Ribosomen lezen de mRNA-sequentie, waardoor de assemblage van aminozuren in een polypeptideketen wordt vergemakkelijkt en het eiwit wordt gevormd dat door het gen wordt gecodeerd.

"In prokaryotische systemen zijn de transcriptie- en translatieprocessen gekoppeld. Dit betekent dat zodra het RNA-polymerase mRNA uit DNA produceert, het ribosoom de ribosomale bindingsplaats op het ontluikende mRNA kan vinden om het eiwit te synthetiseren. Het ontluikende eiwit kan vouwen en functioneren terwijl het nog steeds aan het DNA is vastgemaakt door het RNA-polymerase-mRNA-ribosoomcomplex. Na beëindiging van de transcriptie of translatie valt het ontluikende eiwit van het DNA en verspreidt zich in de bulkoplossing", legt co-auteur Dr. Shirley Shulman Daube van het DNA uit. Weizmann Instituut voor Wetenschap in Israël.

Het belang ligt in de verhoogde lokale concentratie van ontluikende eiwitten, die ongeveer 1000 keer hoger is dan de omringende bulkoplossing. Deze ruimtelijke organisatie en concentratieboost zou gevolgen kunnen hebben voor cellulaire functies en mogelijk een rol kunnen spelen bij de constructie van kunstmatige cellen met behulp van afzonderlijke DNA-moleculen.

Een genetisch circuit bouwen op één enkel DNA-molecuul

"Genetische circuits zijn gebaseerd op genetisch gecodeerde moleculen, zoals transcriptiefactoren, die worden geproduceerd uit DNA en zich terug binden aan het DNA om de productie van hun eigen en andere moleculen te reguleren", zegt co-auteur Dr. Vincent Noireaux van de Universiteit van Minnesota. .

Om het genetische circuit op één enkel DNA-molecuul te bouwen, ontwierpen de onderzoekers specifieke sequenties met lambda-bacteriofaaggenen (E. coli).

Het genetische circuit omvatte een negatieve cascade, geleid door het CI-repressorgen en zijn operator-bindingsplaats, die het HT-gen op ingewikkelde wijze controleerden. Dit HT-gen codeerde voor het HaloTag (HT)-eiwit, een cruciaal element voor het visualiseren van ontluikende eiwitten op individuele DNA-moleculen.

De studie implementeerde strikte omstandigheden, waaronder een lage DNA-oppervlaktedichtheid, om nauwkeurige gelokaliseerde eiwitsynthese te garanderen.

Tegelijkertijd ontvouwde zich een positieve cascade met de fusie van het T7-bacteriofaag-RNA-polymerase (HT-T7 RNAP) en het HT-eiwit, waardoor realtime monitoring van genexpressie via een stroomafwaarts reportergen, GFP, mogelijk werd.

Een verrode fluorogene kleurstof (MaP655-Halo) verbeterde de detectie van ontluikende eiwitten, waardoor een uitgebreid beeld ontstond van de dynamiek van het genetische circuit.

De negatieve cascade, of onderdrukking, reguleert en remt de productie van specifieke eiwitten onder bepaalde omstandigheden. Aan de andere kant dragen positieve cascades bij aan de activering en expressie van specifieke genen binnen het genetische circuit.

Het onderzoek ging verder dan louter observatie en omvatte een feedbackcircuit met een synthetische dCro-repressor. Deze component was cruciaal bij het reguleren van genexpressie via een zorgvuldig ontworpen synthetische promoter.

Vrij van mobiele opsluiting

De onderzoekers ontdekten dat gelokaliseerde eiwitsynthese op een enkel DNA-molecuul genetische circuits kan aansturen in celvrije omstandigheden zonder de opsluiting van cellulaire compartimenten. De dynamiek van genetische circuits werd nauwgezet geobserveerd in zeer verdunde omstandigheden.

Hoofdauteur Dr. Roy Bar-Ziv van het Weizmann Institute of Science in Israël benadrukte het belang van hun bevindingen:‘De regulatie van genexpressie hangt af van de binding van eiwitten aan het DNA, waardoor de activiteit van een gen wordt geblokkeerd of verhoogd. concentraties van eiwitten om specifieke sequenties op het DNA-molecuul te vinden en te binden. Onverwachts ontdekken we dat gelokaliseerde eiwitsynthese de concentratie tijdelijk lang genoeg kan verhogen zodat eiwitten hetzelfde kunnen doen zonder cellulaire opsluiting."

In wezen daagt de bevinding het conventionele idee uit dat hoge concentraties essentieel zijn voor genregulatie, en introduceert een nieuw aspect van gelokaliseerde eiwitsynthese als middel om genetische circuits in celvrije omstandigheden te beïnvloeden.

Voor toekomstig werk overwegen de onderzoekers het gebruik van gelokaliseerde eiwitsynthese als leidend principe om de functionaliteit van kunstmatige cellen opgebouwd uit afzonderlijke DNA-moleculen te verbeteren, en daarmee uitdagingen bij lage concentraties aan te pakken. Ze voorzien ook potentiële toepassingen in zelfgecodeerde nano-apparaten en zijn van plan de correlaties tussen de DNA-structuur, de dynamiek van genexpressie en de eiwitsynthese te onderzoeken.

Het onderzoek omvatte ook bijdragen van Nicolas Lardon en prof. Kai Johnsson van het MPI for Medical Research, die de fluorogene kleurstof (MaP655-Halo) ontwikkelde; Yoav Barak, die hielp bij het optimaliseren van de DNA-voorbereiding; en Leonie Schütz met prof. Elmar Weinhold, die pionierde in de ontwikkeling van methyltransferasen voor plaatsspecifieke DNA-modificaties met biotines.

Meer informatie: Ferdinand Greiss et al, Een genetisch circuit op een enkel DNA-molecuul als een autonoom dissipatief nanoapparaat, Nature Communications (2024). DOI:10.1038/s41467-024-45186-2

Journaalinformatie: Natuurcommunicatie

© 2024 Science X Netwerk