Onderzoekers van het Molecular Biosensor and Imaging Center (MBIC) van de Carnegie Mellon University verhogen de helderheid van een groep fluorescerende sondes, fluoromodules genaamd, die worden gebruikt om de biologische activiteiten van individuele eiwitten in realtime te volgen. Deze nieuwste vooruitgang verbetert hun fluormodule-technologie door deze een orde van grootte helderder te laten gloeien dan typische fluorescerende eiwitten. De nieuwe fluormodules zijn vijf tot zeven keer helderder dan verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP), een ontwikkeling die nieuwe wegen opent voor onderzoek.

In een paper dat online is gepubliceerd in de Tijdschrift van de American Chemical Society , MBIC-onderzoekers onthullen een nieuwe klasse van op dendron gebaseerde fluorogene kleurstoffen genaamd "dyedrons, " die het signaal versterken dat door hun fluormodules wordt uitgezonden.

"Door concepten te gebruiken die zijn ontleend aan de scheikunde, dezelfde concepten die worden gebruikt in zaken als kwantumstippen en zonnecellen die licht oogsten, we waren in staat om een ​​structuur te creëren die werkt als een antenne, het intensiveren van de fluorescentie van de gehele fluoromodule, " zei Marcel Bruchez, universitair hoofddocent scheikunde en programmadirecteur MBIC.

De fluormodules van MBIC bestaan ​​uit een kleurstof die fluorogeen wordt genoemd en een fluorgen-activating protein (FAP). De FAP wordt genetisch tot expressie gebracht in een cel en gekoppeld aan een eiwit van belang, waar het donker blijft totdat het in contact komt met het bijbehorende fluorogeen. Wanneer het eiwit en de kleurstof binden, het complex straalt een fluorescerende gloed uit, waardoor onderzoekers het eiwit gemakkelijk op het celoppervlak en in levende cellen kunnen volgen. Fluormodules zijn uniek omdat ze niet afgewassen hoeven te worden voor specifieke etikettering, ze komen in een spectrum van kleuren, en ze zijn meer fotostabiel dan andere fluorescerende eiwitten.

Om de fluormodules helderder te maken, de onderzoekers versterkten het signaal van een van hun bestaande sondes. Ze namen een van hun standaard fluorogenen, malachiet groen, en gekoppeld aan een andere kleurstof genaamd Cy3 in een complex dat de onderzoekers een 'dyedron' noemden. De dyedron is gebaseerd op een speciaal soort boomachtige structuur, een dendron genaamd, met één malachietgroen molecuul als stam en verschillende Cy3-moleculen als vertakkingen.

De twee kleurstoffen hebben overlappende emissie- en absorptiespectra - Cy3 straalt typisch energie uit op een golflengte waar malachietgroen energie absorbeert - en deze overlap zorgt ervoor dat de kleurstoffen efficiënt energie tussen elkaar kunnen overbrengen. Wanneer de Cy3-kleurstofmoleculen worden geëxciteerd door een lichtbron, zoals een laser, ze "doneren" hun excitatie-energie onmiddellijk aan malachietgroen, het versterken van het signaal dat wordt uitgezonden door het malachietgroen.

Elke dyedron is ongeveer 1-2 nanometer en 3000 g/mol groot. De zeer heldere, maar erg klein, kleurstofdeeltjes stellen de onderzoekers in staat hun onderzoek naar live-cell imaging uit te breiden. Eerder, bij het uitvoeren van microscopie-experimenten met behulp van fluorescerende eiwitten, fluormodules en fluorescerende kleurstoffen, als onderzoekers de helderheid wilden verhogen, ze zouden ofwel de intensiteit van de laser die wordt gebruikt om de eiwitten te visualiseren verhogen of het eiwit dat wordt bestudeerd labelen met talrijke kopieën van de fluorescerende tag. Beide methoden hadden het potentieel om de biologie van het bestudeerde systeem te veranderen, hetzij door de intensere energie die uit de laser komt, hetzij door het toegenomen gewicht dat wordt veroorzaakt door de meerdere tags die aan het eiwit worden toegevoegd. De nieuwe benadering biedt een enkele compacte eiwittag met signaalversterking door slechts een bescheiden vergroting van het beoogde kleurstofmolecuul.

De MBIC-onderzoekers gebruiken momenteel fluormodules om eiwitten op het celoppervlak te bestuderen, en hopen de technologie in de nabije toekomst in cellen te brengen. Aanvullend, ze gaan dyedrons maken voor hun andere bestaande FAP/dye-complexen.