Door Andy Pasquesi
Bijgewerkt 30 augustus 2022

Enzymen versnellen chemische reacties door de activeringsenergie die nodig is voor substraatconversie te verlagen. Het omzetnummer, k_cat , kwantificeert de katalytische efficiëntie van een enzym door het aantal substraatmoleculen te meten dat per actieve enzymsite per seconde wordt omgezet in een product onder verzadigende substraatomstandigheden.

1. Bepalen van initiële reactiesnelheden

Stap 1

Zet de productconcentratie uit tegen de tijd voor het eerste reageerbuisje van uw enzymatische test. Gebruik de tijd op de horizontale as en de productconcentratie op de verticale as.

Stap 2

Bereken de helling van het lineaire deel van de curve (beginsnelheid, V₀ ). In Excel of een grafische rekenmachine geeft de lineaire regressielijn u direct de helling. Als u de voorkeur geeft aan een handmatige schatting, deelt u de verandering in de productconcentratie tussen twee opeenvolgende gegevenspunten door de overeenkomstige verandering in de tijd.

Stap 3

Noteer deze helling als de initiële reactiesnelheid, V₀ , voor die reageerbuis. In de regressievergelijking [Product] = m·time + b , de coëfficiënt m is V₀ .

Stap 4

Herhaal stap 1 t/m 3 voor elk reageerbuisje in de test om een reeks V₀ te verkrijgen waarden bij verschillende substraatconcentraties.

2. V_max berekenen Met behulp van de Lineweaver-Burk-plot

Stap 1

Maak een Lineweaver-Burk-plot (dubbel-reciproque):plot 1/[S] (inverse substraatconcentratie) op de horizontale as en 1/V0 (omgekeerde beginsnelheid) op de verticale as. Als een reageerbuis bijvoorbeeld een initiële substraatconcentratie van 50 µM heeft en een V₀ van 80 µMs ^–1 , zou het geplotte punt zijn (1/50 µM, 1/80 µMs ^–1 ).

Stap 2

Voer een lineaire regressie uit op deze punten. De resulterende vergelijking heeft de vorm 1/V0 = m·(1/[S]) + b , waarbij b is het y-snijpunt.

Stap 3

Bereken de inverse van V_max door het omgekeerde van het y-snijpunt te nemen:1/Vmax = 1/b .

Stap 4

Keer de waarde uit stap 3 om om V_max te verkrijgen :

Vmax = 1/(1/Vmax) = b

Stap 5

Identificeer de enzymconcentratie die in de test wordt gebruikt (deze waarde is constant in alle reageerbuizen en moet in de onbewerkte gegevens worden vermeld).

Stap 6

Bereken k_cat door V_max te delen door de enzymconcentratie:

kcat = Vmax / [E]

Dit levert het aantal substraatmoleculen op dat per seconde per enzym wordt omgezet.

Belangrijkste afhaalmaaltijden

Door deze systematische stappen te volgen:het meten van de beginsnelheden, het construeren van een Lineweaver-Burk-plot, het extraheren van V_max , en normaliseren naar enzymconcentratie:u kunt nauwkeurig het omzetgetal van een enzym bepalen, k_cat , een hoeksteen in de enzymologie en de ontwikkeling van geneesmiddelen.