Bij chemische reacties die worden gekatalyseerd door een enzym, verlaagt het enzym de hoeveelheid activeringsenergie die nodig is door tijdelijk te hechten aan het substraat en het te verdraaien in een gespannen toestand. De k (katalysator) of "kcat" voor de reactie verwijst naar de concentratieonafhankelijke constante voor de snelheid waarmee een bepaald enzym een ​​substraat in een productmolecuul kan metaboliseren. Om kcat te berekenen, mengen wetenschappers eerst verschillende reageerbuizen met verschillende concentraties substraat (bekend als een "enzymatische test") en testen ze met constante tijdsintervallen met een lichtspectrofotometer om de groeiende concentraties van productmoleculen te meten. Deze gegevens worden vervolgens in een grafiek uitgezet en geanalyseerd.

Bereken beginsnelheden voor

Maak een grafiek van de productconcentratie versus de tijd voor de gegevens van de eerste reageerbuis van de enzymatische test. Opmerking: de horizontale as moet "tijd" zijn en de verticale as moet "productconcentratie" zijn.

Bereken de lineaire regressielijn voor de gegevenspunten die u in Sectie 1, stap 1 hebt geplot. Terwijl Excel en grafieken Rekenmachines kunnen dit lineaire model eenvoudig bepalen, u kunt een schatting van de hellingshoek van de regressielijn afleiden door het verschil in productconcentratie tussen aangrenzende gegevenspunten te delen door hun verschil in tijd.

Registreer de helling van de lineaire regressielijn van Sectie 1, Stap 2 als "initiële reactiesnelheid (Vo)." Opmerking: in het regressielijnmodel "[productconcentratie] = m [tijd] + b" is de coëfficiënt "m" de helling.

Herhaal stap 1, 2 en 3 voor de rest van de reageerbuisjes. in de test.

Vmax berekenen

Teken de inverse van de substraatconcentratie voor elke reageerbuis tegen de inverse van de beginsnelheid van de reactie (uit hoofdstuk 1, stap 4). Als de initiële snelheid voor een reageerbuis met een initiële substraatconcentratie van 50 micromolair (uM) bijvoorbeeld 80 uM /s was, zouden de inversen 1/50 uM zijn voor de substraatconcentratie en 1/80 uM /s voor de initiële snelheid. Opmerking: de inverse substraatconcentratie moet op de horizontale as liggen en de inverse beginsnelheid moet op de verticale as liggen.

Opmerking: de substraatconcentratie moet op de horizontale as liggen en de beginsnelheid van de reactie moet op de horizontale as liggen. verticale as.

Bepaal de lineaire regressielijn voor de grafiek die u in Sectie 2, Stap 1 hebt geplot. Opmerking: omdat u de y-kruising voor de regressierechte moet kennen, moet u de punten uit sectie invoeren 2, Stap 1 naar Excel of een grafische rekenmachine en gebruik de ingebouwde regressie-modelleringsfunctionaliteit.

Splits 1 door de y-intersectie van de lineaire regressielijn. Dit geeft je de waarde van de inverse van Vmax, de maximale reactiesnelheid voor het enzym. Opmerking: als het lineaire regressiemodel de vorm heeft van "[Inverse Vo] = m [Inverse substraatconc.] + B", dan is de waarde van "b" de y-kruising. Deel 1 door "b" om de inverse van Vmax te berekenen.

Deel 1 door het resultaat van sectie 2, stap 3 om de werkelijke waarde van Vmax te berekenen.

Bepaal de concentratie van het enzym in de oorspronkelijke test (zie de onbewerkte gegevens). Opmerking: de enzymconcentratie is hetzelfde voor alle reageerbuisjes; alleen de substraatconcentraties variëren in de test.

Deel de Vmax (uit deel 2, stap 4) door de enzymconcentratie (uit deel 2, stap 5). Het resultaat is de waarde van Kcat.