Onderzoekers hebben een labelvrije en niet-invasieve Raman-spectroscopie-aanpak ontwikkeld die microscopische beelden van biologische monsters kan verkrijgen en een breed scala aan biomoleculen kan identificeren met ongekende snelheid en gevoeligheid.

"Ons werk zou kunnen leiden tot een niet-invasief, labelvrij en gebruiksvriendelijk apparaat voor klinisch gebruik", zegt onderzoeksteamleider Dario Polli van Politecnico di Milano in Italië. "Deze innovatieve microscoop, in combinatie met op deep learning gebaseerde algoritmen, zou het uiteindelijk gemakkelijker en sneller kunnen maken om kanker te diagnosticeren door de visualisatie van de chemische bestanddelen van menselijke weefsels en cellen mogelijk te maken."

In het tijdschrift Optics Express , beschrijven de onderzoekers hun nieuwe techniek, die gebaseerd is op coherente anti-stokes Raman scattering (CARS) microscopie. CARS-microscopie produceert beelden op basis van de trillingskenmerken van moleculen door gebruik te maken van de interactie tussen ultrakorte laserpulsen en biologische monsters.

De nieuwe benadering biedt toegang tot het moeilijk te detecteren gebied van het trillingsspectrum dat bekend staat als het vingerafdrukgebied, dat zich uitstrekt van 400 tot 1800 cm ⁻¹ . Hoewel veel individuele verbindingen in dit gebied kunnen worden geïdentificeerd met behulp van hun vibrationele vingerafdrukken, heeft het de neiging om zwakke signalen te produceren die moeilijk te detecteren zijn.

"Veelgebruikte technieken in de biomedische wetenschappen vereisen vaak kleuring, wat niet alleen omslachtig is, maar ook structurele en chemische veranderingen kan introduceren die kunnen leiden tot artefacten of fouten in beeldvorming en gegevensverwerking", zei Polli. "Omdat ons systeem onderscheid kan maken tussen veel verschillende chemische soorten in biologische weefsels zonder labels, kan het nuttig zijn voor beeldvorming van levende cellen en het analyseren van weefselbiopten."

Lagere herhalingsfrequentie, snellere beeldvorming

Dit nieuwe werk maakt deel uit van het CRIMSON-project, dat tot doel heeft een kant-en-klaar beeldvormingsapparaat te ontwikkelen dat vibratiespectroscopie gebruikt voor snelle cel- en weefselclassificatie. Het doel van het project is om de studie van de cellulaire oorsprong van ziekten te transformeren om nieuwe benaderingen mogelijk te maken die gepersonaliseerde therapie kunnen bevorderen.

Als een belangrijke stap in de richting van dit doel ontwikkelden de onderzoekers een CARS-microscoop op basis van een commerciële laser die ultrakorte pulsen produceert met een duur van ongeveer 270 femtoseconden in het nabij-infrarode golflengtebereik. Ze ontwierpen het microscopiesysteem om laserpulsen te gebruiken met een herhalingssnelheid van 2 MHz, wat veel lager is dan de 40 of 80 MHz die door de meeste andere CARS-systemen wordt gebruikt.

Deze lagere herhalingssnelheid vermindert de fotothermische schade aan het monster omdat er een vertraging van 0,5 microseconde ontstaat tussen twee opeenvolgende pulsen. Het produceert ook een hogere pulsenergie en piekintensiteit op het brandpunt, wat een sterker CARS-signaal genereert en een hogere acquisitiesnelheid mogelijk maakt.

"Het belangrijkste voordeel van de lagere herhalingssnelheid is dat het ons in staat stelde om breedband, roodverschoven Stokes-pulsen te genereren die het hele trillingsgebied van de vingerafdrukken bedekken door gebruik te maken van witlicht supercontinuümgeneratie in een bulkkristal", zegt Federico Vernuccio, promovendus bij Politecnico di Milano en eerste auteur van de studie. "Vergeleken met andere methoden is deze aanpak technisch eenvoudiger, compacter en robuuster."

Het gebruik van een spectraal gebied dat rood is verschoven in vergelijking met standaardopstellingen, betekent dat hogere laserintensiteiten kunnen worden gebruikt vóór het begin van fotoschade. De onderzoekers ontwikkelden ook nieuwe algoritmen die standaard numerieke computationele benaderingen combineren met kunstmatige intelligentie. Deze algoritmen halen meer informatie uit de verkregen gegevens en zetten deze om in afbeeldingen waarmee verschillende chemische soorten gemakkelijk kunnen worden onderscheiden.

"Dankzij onze verbeteringen levert het CARS-systeem beelden van hoge kwaliteit met een ultramoderne acquisitiesnelheid", aldus Vernuccio. "Ons systeem heeft een pixelverblijftijd van minder dan 1 milliseconde zonder de integriteit van het monster in gevaar te brengen. Deze snelheid wordt beperkt door de verversingssnelheid van de spectrometer."

Hoge snelheidsgevoeligheid

Om hun systeem te testen, gebruikten de onderzoekers referentiemonsters om spectra die met de nieuwe microscoop waren opgehaald, te vergelijken met die verkregen met behulp van een ultramoderne, hoewel langzamere, vibrationele spectroscopietechniek. De twee methoden lieten een uitstekende overeenstemming zien, wat aantoont dat het nieuwe systeem spectra met zeer hoge snelheden kon leveren met een goede spectrale resolutie en chemische specificiteit.

De onderzoekers bepaalden vervolgens de detectielimiet van hun systeem door CARS-spectra te verkrijgen van een reeks dimethylsulfoxide-oplossingen met verschillende concentraties. Het systeem was in staat om chemische concentraties te meten met de ongekende gevoeligheid van 14,1 mmol/liter, ongeveer het dubbele van de gevoeligheid van andere CARS-systemen die in het vingerafdrukgebied werken.

Ze toonden ook het vermogen van het systeem om verschillende transparante plastic kralen van micronformaat te onderscheiden en ruimtelijk te lokaliseren op basis van hun vibratiesignatuur en namen metingen van biologische weefsels om aan te tonen dat de techniek werkt op biologische monsters zonder schade te veroorzaken.

"Onze CARS-microscoop maakt labelvrije beeldvorming met chemische specificiteit bij hogere snelheden mogelijk, waardoor Raman-beeldvorming van levende cellen haalbaarder wordt", zei Polli. "Hierdoor kan ons systeem bijvoorbeeld worden gebruikt om de interacties van kankercellen met immuuncellen te analyseren of om te karakteriseren hoe chemotherapie cellen beïnvloedt."

De onderzoekers werken nu aan het verbeteren van hun systeem door een nog breder golflengtebereik van Stokes-pulsen te creëren door middel van het genereren van supercontinuüm van wit licht. Dit zou zowel de snelheid van beeldvorming als het aantal detecteerbare chemische analyten verbeteren. Ze werken ook aan commercialisering door gebruiksvriendelijke software, compacte optische bronnen en ontwerpen voor een commercieel prototype en detectiesysteem te ontwikkelen. + Verder verkennen

THz-vingerafdruk vibrationele spectroscopie met een ultrasnelle spectrale snelheid