Biologen gebruiken vaak fluorescentiemicroscopie vanwege de moleculaire specificiteit en superresolutie van de techniek. Echter, de methode wordt tegengehouden door beeldvormingslimieten. In een nieuw verslag over wetenschappelijke vooruitgang , Matz Liebel en een onderzoeksteam van het Barcelona Institute of Science and Technology en het Massachusetts General Hospital in Spanje en de VS rapporteerden een beeldvormende benadering om het volledige elektrische veld van fluorescerend licht te herstellen met behulp van de gevoeligheid van één molecuul. Het team experimenteerde met het concept van digitale holografie voor snelle fluorescentiedetectie door het driedimensionale (3-D) traject van individuele nanodeeltjes te volgen met een resolutie van 15 nanometer in het vlak. Als proof-of-concept biologische toepassingen, de onderzoekers beeldden de 3D-beweging van extracellulaire blaasjes in levende cellen af.

Nano-afgifte in levend weefsel

In dit werk, Liebel et al. ontwikkelde op fluorescentieholografie gebaseerde 3D-deeltjeslokalisatie over extracellulaire blaasjes in levende cellen en observeerde sterk opgesloten blaasjes met perioden van actief transport. Het leveren van vrachtvervoer in vivo is momenteel een grote uitdaging, om actief minimaal invasieve nanogeneeskundeplatforms te implementeren. Nanodeeltjes (NP's) en extracellulaire voertuigen kunnen worden ontworpen als veelbelovende kandidaten om als voertuigen te leveren, maar wetenschappers begrijpen de precieze reis van dergelijke apparaten in levend weefsel nog niet.

Om deze uitdagingen te overwinnen, ze moeten wide-field driedimensionale (3-D) single-particle imaging-methoden ontwikkelen om individuele deeltjes tegelijkertijd te volgen terwijl ze naar hun beoogde bestemming reizen. Onderzoeksteams hadden eerder holografische benaderingen van microscopie geïmplementeerd, hoewel de incoherentie van fluorescerend licht niet goed geschikt is voor levende cellen of beeldvorming met één molecuul. In vergelijking, shearing interferometrie is een veelbelovende methode om enkelvoudige opname van dynamische processen te realiseren. Het onderliggende idee achter afschuifinterferometrie omvat zelfinterferentie om toegang te krijgen tot fasegradiënten tot op een enkel fotonniveau om single shot fluorescentieholografie te bereiken. De mechanismen die in dit werk zijn ontwikkeld, dienen daarom om intracellulaire translocatie over micrometer-lengteschalen te observeren om biologen een dieper inzicht te geven in intracellulaire mechanismen.

Beeldvormingsprincipe en systeemvalidatie voor het volgen van 3D-deeltjes

Het team gebruikte een wide-field fluorescentiemicroscoop met een wavefront shearing-sensor bestaande uit een relay-beeldvormingssysteem. De geometrie van de opstelling zorgde ervoor dat fasegradiënten die niet nul waren werden gemeten en Liebel et al. om zelfinterferentie met één foton uit te voeren over een volledig beeld. Het team beeldde fluorescerende polystyreenkralen af ​​als onscherpe 200 nm-deeltjes en haalde de intensiteitsinformatie eruit als argumentmodulus van de gefilterde afbeeldingen voor fasegradiëntextractie. Na het observeren van het volledige elektrische veld, ze gebruikten Fourier-optica om complexe door verstrooiing veroorzaakte aberraties te corrigeren of afbeeldingen te construeren op elk gewenst vlak. Het team concentreerde zich op 3D-lokalisatie-experimenten die het herstel van de precieze positie van een van belang zijnde emitter over alle dimensies vereisten, inclusief het Z-vlak. Computational focusinspanningen wezen op het precieze vermogen om de 3D-positie van meerdere vrij verspreidende fluorescerende deeltjes te bepalen.

Het computationele focusseringstraject testen

Om computationele redenering achter de opstelling te testen, Liebel et al. genereerde een bekend 3D-traject en verplaatste een monster met geïmmobiliseerde fluorescerende kralen - terwijl beelden langs het pad werden opgenomen. Ze herstelden de fase- en amplitude-informatie en bepaalden de 3D-posities van individuele deeltjes met behulp van numerieke voortplanting. Om het toegankelijke Z-bereik te kwantificeren, ze hebben afzonderlijke deeltjes experimenteel onscherp gemaakt en vervolgens de afbeeldingen computationeel opnieuw gefocust om artefactvrije metingen te verkrijgen over een Z-bereik van ongeveer acht m. Het is belangrijk om te zorgen voor nauwkeurige lokalisatie op nanoschaal over schalen met een lengte van micrometers in 3D om diffunderende deeltjes op nanoschaal af te beelden. Fluorescentieholografie voldeed aan deze eisen. Als proof-of-concept, de wetenschappers beeldden het woord "holografie, " waarbij elke afzonderlijke invoerletter minder dan 50 nm breed was om een ​​goed opgeloste uitvoer te verkrijgen, bevestiging van de superresolutiecapaciteit van fluorescerende holografie.

Beeldvorming met één molecuul en de cellulaire opname van nanodeeltjes

Het team liet zien hoe fluorescentieholografie functioneerde onder biologisch belangrijke superresolutie-omstandigheden door een monster te meten dat was samengesteld uit individuele moleculen. Ondanks duidelijk verminderde fluorescentie-intensiteiten in de experimentele opstelling, het team behaalde computationele focus tot de diffractielimiet, zelfs voor fotonniveaus zo laag als 10 ⁴ fotonen. Ze visualiseerden intracellulaire handel in anorganische nanodeeltjes en extracellulaire blaasjes met behulp van het systeem. Als modelsysteem ze gebruikten fluorescent gelabelde gouden nanostaafjes die inert zijn en daarom zonder interferentie met cellulaire functies om zich op te hopen in het cytoplasma, zoals geverifieerd met behulp van donkerveldbeelden van levende cellen. Het team volgde de banen van deeltjes door time-lapse-fluorescentiebeelden op te nemen en de fase- en amplitudetermen te extraheren. De sterk variërende puntspreidingsfuncties (PSF's) wezen op de aanwezigheid van nanostaafjes op verschillende Z-posities ten opzichte van het brandvlak.

Het team voerde 3D-lokalisatie uit van elke individuele nanostaaf in de cel en reconstrueerde deeltjestrajecten over 100 observatiekaders om zes representatieve categorieën te verkrijgen, waar sommige deeltjes onbeweeglijk waren tijdens de observatietijd van 200 seconden, terwijl anderen vrij verspreid over meerdere micrometers. De resterende deeltjes vertoonden zowel gebonden als diffunderende toestanden. Op deze manier, de onderliggende fluorescentie-holografiemethode zou 3D-posities nauwkeurig kunnen bepalen.

Cellulaire opname en actief transport van extracellulaire blaasjes

Liebel et al. bestudeerde vervolgens het actieve 3D-transport van extracellulaire blaasjes (EV's) in levende cellen door HeLa-cellen te incuberen met fluorescerend gelabelde EV's. Ze verwierven elke vier seconden fluorescerende hologrammen om 3D-trajecten van individuele EV's te reconstrueren door een combinatie van geautomatiseerde en handmatige trajecten, het koppelen van de 3D EV-posities. Liebel et al. overlappende time-lapse-amplitudeprojecties van fluorescerende hologrammen met gelijktijdig opgenomen helderveldbeelden van individuele cellen, om te laten zien hoe de meeste EV's waren gelokaliseerd aan de rand van de hechtende cellen. De waarnemingen en berekeningen suggereerden dat de EV's vastzaten in een gebied, hun beweging beperken tot een bepaald volume; waarschijnlijk behorend tot het cellulaire cytoskelet.

Outlook

Op deze manier, Matz Liebel en collega's bedachten een groot gezichtsveld single-shot fluorescentie holografie methode om 3D single-particle tracking over een Z-bereik van ongeveer acht micrometer mogelijk te maken. Om dit concept te bewijzen, het team implementeerde een eenvoudige experimentele opstelling met een geoptimaliseerde fotonendoorvoer. Dankzij de geoptimaliseerde functies was fluorescentieholografie een ideale benadering om het volgen van deeltjes in realtime te bestuderen. Het team toonde 3D-tracking van één deeltje en observeerde de beweging van objecten op nanoschaal in levende cellen, zoals fluorescent gelabelde gouden nanostaafjes en EV's (extracellulaire blaasjes). Terwijl gouden nanostaafjes alleen in het cytoplasma aggregeerden zonder internalisatie in de kern, de EV's verzamelden zich aan de randen van hechtende cellen in een verdringingseffect. Liebel et al. verwacht extra kleuring uit te voeren om het intracellulaire cytoskelet te identificeren, waardoor de intracellulaire architectuur wordt verbonden met de beweging van extracellulaire blaasjes. Deze inspanningen zullen licht werpen op de precieze mechanismen van vrachtvervoer en de internalisatie van deeltjes in cellen met belangrijke toepassingen in nanogeneeskunde om kritische vragen in biologie en geneeskunde te beantwoorden. Het mechanisme is even geschikt om andere volumetrische beeldvormingsmethoden uit te voeren om binnen weefsels te volgen en voor biochemische calciumbeeldvorming.

© 2020 Wetenschap X Netwerk