Biochemici kunnen elektronen-paramagnetische resonantie (EPR) gebruiken op enkele eiwitkristallen om de uiteindelijke elektronische structuur van paramagnetische eiwittussenproducten te bepalen en de relatieve magnetische tensor van een moleculaire structuur te onderzoeken. De methode is, echter, ingehouden door typische eiwitkristalafmetingen (0,05 tot 0,3 mm) die niet voldoende signaalintensiteit bieden tijdens eiwitkristallografie. In een nieuwe studie over wetenschappelijke vooruitgang , Jason W. Sidabras en een interdisciplinair onderzoeksteam in de afdelingen Chemical Energy Conversion, Fotobiotechnologie, Instituut voor Biologie en Experimentele Fysica in Duitsland presenteerde een microgolf zelfresonante microhelix om nanolitermonsters te kwantificeren. De wetenschappers implementeerden de techniek in een commerciële X-band (mid-range frequentie; 9,5 GHz) EPR-spectrometer. De zelfresonerende microhelix zorgde voor een gemeten signaal-ruisverbetering in vergelijking met andere commerciële EPR-resonatoren. Het werk maakt geavanceerde EPR-technieken mogelijk om eiwit-enkelkristallen te bestuderen voor röntgenkristallografie, zonder maatgerelateerde uitsluitingen of uitdagingen. Om de methode te demonstreren, Sidabras et al. gebruikte eenkristalproteïne [FeFe]-hydrogenase (van Clostridium pasteurianum ) met afmetingen van 0,3 mm bij 0,1 mm bij 0,1 mm.

Primaire auteur Jason W. Sidabras, momenteel een Marie Sklowdowska-Curie Actions Fellow aan het Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion in Duitsland, gaf verder commentaar op het werk dat werd uitgevoerd met collega-onderzoekers Professor Wolfgang Lubitz en Dr. Edward J. Reijerse. "Hoewel we hier zijn begonnen met [FeFe]-hydrogenase, we hebben jarenlang geprobeerd de dynamiek van eenkristal EPR te onderzoeken en de huidige technologie is niet beperkt tot alleen overgangsmetalen. De methode die in het onderzoek is gedefinieerd, is van toepassing om elke enzymatische activiteit binnen een stabiel eiwittussenproduct te volgen." Hij merkte verder op dat ze de technologie willen gebruiken om de bestaande kosten van puls-EPR-technologie te verlagen en dure krachtige versterkers te vervangen voor zuinige wetenschap (economisch kosteneffectieve strategieën in de wetenschap).

Wetenschappers gebruiken doorgaans EPR-spectroscopie om de katalytische cyclus van redox-enzymen die paramagnetische tussenproducten bevatten te onderzoeken en om informatie te verkrijgen over de elektronische en geometrische structuur van een actieve enzymatische site. Over het algemeen, om EPR-experimenten op eiwitten uit te voeren, onderzoekers bereiden een bevroren oplossing (concentratie tussen 0,1 tot 1 mM) en plaatsen een volume (200 µl) in een microgolfholte om magnetische interacties op een actieve plaats te verkrijgen, met beperkt zicht op de elektronische structuur. Om de parameters voor magnetische tensor-interactie volledig op te lossen, ze moeten eenkristal EPR-experimenten uitvoeren waarbij magnetische interactietensoren kunnen worden gecombineerd met röntgenkristallografie om eiwitgeometrie aan te tonen en katalytische mechanismen van enzymen te begrijpen. Echter, eenkristal EPR wordt zelden toegepast op eiwitsystemen vanwege de uitdagingen bij het verkrijgen van kristallen met de juiste volumes en afmetingen. Veel eiwitten in het bereik van 0,05 tot 0,3 mm zijn te klein voor analyse met commerciële EPR-instrumenten.

Om de EPR-gevoeligheid voor het bestuderen van eenkristallen te verbeteren, typisch op de X-band, onderzoekers moeten het ontwerp van de microgolfholte verlaten en overgaan naar resonatoren met een klein volume in het microgolfbereik. De strategie kan gereduceerde monstervolumes van 200 tot 20 µl mogelijk maken met behulp van een loop-gap resonator (LGR) en aanvullende reducties met materialen met een hoge diëlektrische constante om het actieve volume te verminderen tot één microliter. Eiwit-eenkristalonderzoeken vereisen nog verdere volumeverminderingen (minder dan 0,03 µl) en dat vraagt ​​om een ​​radicale aanpak. Om dit te bereiken, Sidabras et al. combineerde een zelfresonerende microhelix en een vlakke microcoupler op een printplaatopstelling, die de zelfresonerende microhelix aandreef die in het midden van de koppelingslus was geplaatst. De microhelix-geometrie bood voordelen met een sterk verbeterde homogeniteit van het microgolfveld en een hogere volumegevoeligheid voor kleine monsters in vergelijking met andere microresonatoren. Het team optimaliseerde de zelfresonerende microhelix voor puls- en continue-golfexperimenten die zeer weinig microgolfvermogen vereisen. Ze matchten en stemden de microhelix gemakkelijk af op verschillende monsters en temperaturen.

In het huidige werk, het team gebruikte de zelfresonante microhelix om EPR-kristalrotatie van [FeFe]-hydrogenase in de actieve geoxideerde toestand (H _OS ; kristalafmetingen 3 mm bij 0,1 mm bij 0,1 mm), van Clostridium pasteurianum (anaërobe bacterie). Ze voerden geavanceerde puls-EPR-experimenten uit op de structuur om een ​​uitstekende signaal-ruisverhouding te observeren. De gegevens toonden het gebruik van de microhelix aan om monokristallijne eiwitten te bestuderen bij volumes die geschikt zijn voor röntgenkristallografie. Tijdens experimenten, het onderzoeksteam wikkelde de zelfresonante microhelix-geometrie rond een capillair van 0,4 mm en bevestigde de assemblage op een op maat gemaakt inzetstuk dat compatibel is met commerciële EPR-systemen. Ze voerden een continu-golf EPR-experiment uit met behulp van een bevroren oplossing en verbeterden de signaal-ruisverhouding (SNR) van het werk met behulp van een veld-swept nonadiabatic rapid scan (NARS) experiment.

Ze gebruikten een langlevende tyrosine D-radicaal (Y∙D) als standaardsonde tijdens experimenten met eerder goed gekarakteriseerde eigenschappen. Om het tyrosineradicaal (Y∙D) EPR-signaal te genereren, het team verlichtte monsters van het fotosysteem II-kerncomplex (membraaneiwitcomplex) in omgevingslicht en bevroor ze snel. Ze voerden meerdere experimenten uit om de veelzijdigheid van de microhelix aan te tonen tijdens EPR-metingen over een verscheidenheid aan monsters (minder dan 85 nanoliter in volume) op de X-band. Sidabras et al. gebruikte de kristallen van het fotosysteem II als maatstaf, ondanks zijn uitdagende samenstelling. structureel, het fotosysteem II-complex bevatte een molecuulmassa van ongeveer 350 kDa, waarbij elke component slechts één Y∙D-radicaal bevatte. In totaal, met acht fotosysteem II-complexen per eenheidscel berekenden de wetenschappers 8,9 x 10 ¹² Y∙D radicalen, om de veelzijdigheid van de EPR-methode aan te tonen om grote complexen in kleine kristaldimensies te bestuderen.

Na het vaststellen van de geschiktheid van de zelfresonante microhelix om monokristallijne eiwitmonsters te bestuderen, het team breidde het werk uit om volledige angulaire g-tensorbepaling (energieverschuiving geassocieerd met moleculaire transitie) te demonstreren en om geavanceerde puls-EPR-experimenten te onderzoeken, zoals elektron-spin-echo-envelopmodulatie (ESEEM) of hyperfijne subniveau-correlatie (HYSCORE). Ze optimaliseerden de zelfresonerende microhelix voor deze experimenten. Het team veld-geveegde twee-puls ESE (elektronen spin echo) EPR-experimenten op een eiwit eenkristal van de [FeFe]-hydrogenase van C. pasteurianum (Cpl) in het geoxideerde H _OS toestand in een anerobe kamer onder een microscoop om eiwitkristallen via capillaire werking in een capillair buisje op te nemen.

Ze namen vervolgens cryoprotectant en media in de microhelix op, gevolgd door flash-freezing om een ​​EPR-signaal te produceren met vier verschillende signalen in het spectrum ten opzichte van de eiwitstructuur. De wetenschappers pasten de gegevens in simulaties met betrekking tot verschillende referentiekaders die zijn gedefinieerd via het EasySpin-simulatiepakket voor EPR-spectrumsimulatie. Het team creëerde een schema dat het [FeFe]-hydrogenase H-cluster moleculaire frame relateert aan het laboratoriumsysteemframe. Voor alle soorten die in de experimenten zijn onderzocht, het team bepaalde de grootte en oriëntatie van de g-tensor met behulp van de ligand-veldtheorie en verifieerde de resultaten met behulp van kwantumchemische berekeningen. Het team faciliteerde fundamentele inzichten in de elektronische structuur en merkte hun afhankelijkheid van de ligandsfeer op en observeerde de noodzaak van geoptimaliseerde strategieën.

The researchers illustrated more advanced experiments for single-crystal studies using HYSCORE (hyperfine sublevel correlation) experiments for the ESE (electron spin echo) EPR dataset. Voor deze, they obtained a single-crystal 2-D spectrum for the H-cluster in [FeFe]-hydrogenase crystals and identified six main transitions. Sidabras et al. highlighted the feasibility of these advanced EPR techniques in the present work and related them to the electronic structure predicted using quantum chemical calculations. The team aim to address additional molecular couplings of ligands in depth using ESEEM/HYSCORE techniques in the future.

Op deze manier, Jason W. Sidabras and colleagues presented an advanced resonator to design and collect EPR data from a 3 mm by 0.1 mm by 0.1 mm single crystal of [FeFe]-hydrogenase in the H _OX state from C. pasteurianum (Cpl). The HYSCORE spectra obtained from a protein single crystal in the present work were a first in study. Additional work proposed by the team will facilitate further insight for protein engineering and artificial enzyme research to create bioinspired and biomimetic enzymatic systems. Opmerkelijk, the self-resonant microhelix engineered in the work can allow biochemists to study diverse catalytically active proteins at crystal dimensions relative to X-ray crystallography, which will pave the way for significant advancements in the field of enzyme research.

© 2019 Wetenschap X Netwerk