Een internationaal team van wetenschappers heeft voor het eerst een röntgenvrije-elektronenlaser gebruikt om de structuur van een intact virusdeeltje op atomair niveau te ontrafelen. De gebruikte methode vermindert de benodigde hoeveelheid virusmateriaal drastisch, terwijl de onderzoeken ook meerdere keren sneller kunnen worden uitgevoerd dan voorheen. Dit opent geheel nieuwe onderzoeksmogelijkheden, zo meldt het onderzoeksteam onder leiding van DESY-wetenschapper Alke Meents in het tijdschrift Natuurmethoden .

Op het gebied dat bekend staat als structurele biologie, wetenschappers onderzoeken de driedimensionale structuur van biologische moleculen om erachter te komen hoe ze functioneren. Deze kennis vergroot ons begrip van de fundamentele biologische processen die plaatsvinden in organismen, zoals de manier waarop stoffen in en uit een cel worden getransporteerd, en kan ook worden gebruikt om nieuwe medicijnen te ontwikkelen.

"Het kennen van de driedimensionale structuur van een molecuul zoals een eiwit geeft veel inzicht in zijn biologische gedrag, " legt co-auteur David Stuart uit, Directeur van Life Sciences bij de synchrotron-faciliteit Diamond Light Source in het VK en een professor aan de Universiteit van Oxford. "Een voorbeeld is hoe het begrijpen van de structuur van een eiwit dat een virus gebruikt om aan een cel te 'haken' zou kunnen betekenen dat we een verdediging voor de cel kunnen ontwerpen om het virus niet in staat te stellen om het aan te vallen."

Röntgenkristallografie is verreweg het meest productieve hulpmiddel dat door structurele biologen wordt gebruikt en heeft al de structuren van duizenden biologische moleculen onthuld. Er worden minuscule kristallen van het betreffende eiwit gekweekt, en vervolgens verlicht met behulp van hoogenergetische röntgenstralen. De kristallen buigen de röntgenstralen op karakteristieke manieren af, zodat de resulterende diffractiepatronen kunnen worden gebruikt om de ruimtelijke structuur van het kristal - en dus van zijn componenten - op atomaire schaal af te leiden. Echter, eiwitkristallen zijn lang niet zo stabiel en stevig als zoutkristallen, bijvoorbeeld. Ze zijn moeilijk te kweken, vaak klein blijven, en worden gemakkelijk beschadigd door de röntgenstralen.

"Röntgenlasers hebben een nieuwe weg geopend naar eiwitkristallografie, omdat hun extreem intense pulsen kunnen worden gebruikt om zelfs extreem kleine kristallen te analyseren die met andere röntgenbronnen geen voldoende helder diffractiebeeld zouden produceren, ", voegt co-auteur Armin Wagner van Diamond Light Source toe. elk van deze microkristallen kan slechts een enkel diffractiebeeld produceren voordat het verdampt als gevolg van de röntgenpuls. Om de structuuranalyse uit te voeren, Hoewel, honderden of zelfs duizenden diffractiebeelden zijn nodig. Bij dergelijke experimenten wetenschappers injecteren daarom een ​​fijne vloeibare straal eiwitkristallen door een gepulste röntgenlaser, die een snelle opeenvolging van extreem korte bursts vrijgeeft. Elke keer dat een röntgenpuls een microkristal raakt, een diffractiebeeld wordt geproduceerd en geregistreerd.

Deze methode is zeer succesvol en is al gebruikt om de structuur van meer dan 80 biomoleculen te bepalen. Echter, het meeste monstermateriaal wordt verspild. "Het slagingspercentage is meestal minder dan twee procent van de pulsen, dus de meeste kostbare microkristallen belanden ongebruikt in de opvangbak, " zegt Meents, die is gevestigd in het Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) in Hamburg, een samenwerking van DESY, de Universiteit van Hamburg en de Duitse Max Planck Society. De standaardmethode vereist daarom typisch enkele uren straaltijd en aanzienlijke hoeveelheden monstermateriaal.

Om de beperkte bundeltijd en het kostbare monstermateriaal efficiënter te gebruiken, het team ontwikkelde een nieuwe methode. De wetenschappers gebruiken een chip met micropatroon die duizenden kleine poriën bevat om de eiwitkristallen vast te houden. De röntgenlaser scant vervolgens de chip lijn voor lijn, en idealiter maakt dit het mogelijk een diffractiebeeld op te nemen voor elke puls van de laser.

Het onderzoeksteam testte zijn methode op twee verschillende virusmonsters met behulp van de LCLS-röntgenlaser in het SLAC National Accelerator Laboratory in de VS, die 120 pulsen per seconde produceert. Ze laadden hun monsterhouder met een kleine hoeveelheid microkristallen van het bovine enterovirus 2 (BEV2), een virus dat miskramen kan veroorzaken, doodgeborenen, en onvruchtbaarheid bij runderen, en die zeer moeilijk te kristalliseren is.

In dit experiment, de wetenschappers bereikten een slagingspercentage - waarbij de röntgenlaser met succes het kristal richtte - van maximaal negen procent. Binnen slechts 14 minuten hadden ze voldoende gegevens verzameld om de juiste structuur van het virus te bepalen - die al bekend was uit experimenten bij andere röntgenlichtbronnen - tot op een schaal van 0,23 nanometer (miljoensten van een millimeter).

"Voor zover wij weten, dit is de eerste keer dat de atomaire structuur van een intact virusdeeltje is bepaald met behulp van een röntgenlaser, Meents merkt op. "Terwijl eerdere methoden bij andere röntgenlichtbronnen kristallen met een totaal volume van 3,5 nanoliter vereisten, we zijn erin geslaagd om kristallen te gebruiken die meer dan tien keer kleiner waren, met een totaal volume van slechts 0,23 nanoliter."

Dit experiment werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. Terwijl het koelen van de eiwitkristallen ze tot op zekere hoogte zou beschermen tegen stralingsschade, dit is over het algemeen niet haalbaar bij het werken met extreem gevoelige viruskristallen. Kristallen van geïsoleerde viruseiwitten kunnen, echter, worden bevroren, en in een tweede test, de onderzoekers bestudeerden het virale eiwit polyhedrine dat een viraal occlusielichaam vormt voor enkele duizenden virusdeeltjes van bepaalde soorten. De virusdeeltjes gebruiken deze containers om zich te beschermen tegen omgevingsinvloeden en kunnen daardoor veel langer intact blijven.

Voor de tweede toets de wetenschapper laadde hun chip met polyhedrin-kristallen en onderzocht ze met behulp van de röntgenlaser terwijl de chip bij temperaturen onder de min 180 graden Celsius werd gehouden. Hier, de wetenschappers bereikten een hit rate tot 90 procent. In amper tien minuten tijd hadden ze meer dan genoeg diffractiebeelden gemaakt om de eiwitstructuur tot op 0,24 nanometer nauwkeurig te bepalen. "Voor de structuur van veelvlak, we hoefden maar één chip te scannen die was geladen met vier microgram eiwitkristallen; dat is een orde van grootte kleiner dan het bedrag dat normaal gesproken nodig zou zijn, ’, legt Meents uit.

"Onze aanpak vermindert niet alleen de tijd die nodig is voor het verzamelen van gegevens en de hoeveelheid monster die nodig is, het opent ook de mogelijkheid om hele virussen te analyseren met behulp van röntgenlasers, Meents vat het samen. De wetenschappers willen nu de capaciteit van hun chip met een factor tien vergroten, vanaf 22, 500 tot ongeveer 200, 000 microporiën, en de scansnelheid verder verhogen tot wel duizend samples per seconde. Dit zou het potentieel van de nieuwe röntgenvrije-elektronenlaser European XFEL beter benutten, die net in de Hamburg-regio in gebruik wordt genomen en tot 27, 000 pulsen per seconde. Verder, de volgende generatie chips zal alleen die microporiën blootleggen die momenteel worden geanalyseerd, om te voorkomen dat de resterende kristallen worden beschadigd door verstrooide straling van de röntgenlaser.

Onderzoekers van de Universiteit van Oxford, de Universiteit van Oost-Finland, het Zwitserse Paul Scherrer Instituut, het Lawrence Berkeley National Laboratory in de VS en SLAC waren ook betrokken bij het onderzoek. Diamantwetenschappers hebben samengewerkt met het team van DESY, waarbij een groot deel van de ontwikkeling en het testen van de chip met micropatroon wordt gedaan op Diamond's I02- en I24-bundellijnen.