Fluorescentie is een ongelooflijk nuttig hulpmiddel voor experimentele biologie en het is nu eenvoudiger om aan te boren, dankzij het werk van een groep onderzoekers van de Universiteit van Chicago.

De groep creëerde een nieuwe tool als onderdeel van een laboratoriumklas binnen het afstudeerprogramma Biophysical Sciences aan de Universiteit van Chicago, waardoor zijn gebruikers zich kunnen concentreren op het spectrum van specifieke structuren in monsters.

"Het grootste deel van het werk werd gedaan door afgestudeerde studenten tijdens hun eerste semester, " zei Adam Hammond, curriculumdirecteur en hoofddocent bij de opleiding Biophysical Sciences van het Gordon Centre for Integrative Sciences. "Hun enthousiasme en creativiteit hebben dit project mogelijk gemaakt."

Zoals de groep deze week in het journaal meldt Beoordeling van wetenschappelijke instrumenten , van AIP Publishing, het doel van hun instrumentatie is om het lichtspectrum te observeren dat afkomstig is van een deel van een monster op een microscoop, maar niet het hele monster.

"De waarde van een microscoop is dat je de variaties binnen een monster kunt observeren, " legde Hammond uit. "We wilden kunnen vragen, 'wat is het spectrum van die specifieke structuur daar?' Dit is geen nieuw verlangen en instrumenten die het kunnen doen bestaan, maar geen, voor zover ik weet, net zo eenvoudig als de onze."

Tijdens zijn eerste jaar op de graduate school, Peter Dahlberg, eerste auteur van het artikel die nu aan de Stanford University in Californië werkt, moest een selectieve excitatiemicroscoop bouwen. "Onbewust, Ik denk dat het idee toen begon, "zei hij. "Waarom niet hetzelfde doen, maar omgekeerd?"

Hoe werkt de tool van de groep? Eerst, het splitst het licht dat uit een monster komt. De helft gaat naar een camera voor normale beeldvorming en de andere helft gaat naar een spectrometer. Maar voordat het bij de spectrometer komt, die helft passeert een paar optische componenten waarmee gebruikers elk willekeurig deel van het beeld kunnen kiezen en al het andere kunnen blokkeren.

"Er is niets lastigs aan deze optische componenten - een ruimtelijke lichtmodulator (SLM) tussen gekruiste polarisatoren, "Zei Hammond. "SLM's zijn nu gebruikelijk, met ten minste drie in veel moderne digitale projectoren. Ze hebben een reeks pixels die elk de fase van het licht dat er doorheen gaat kunnen manipuleren."

Hoewel er verschillende trucs zijn die je kunt doen met een SLM, de groep gebruikt de meest eenvoudige.

"We richten het beeld van het monster op de SLM en verschuiven de fase van alleen die pixels waarvan we een spectrum willen verkrijgen, " vervolgde hij. "Het verschoven licht gaat door een tweede polarisator; al het andere wordt geblokkeerd. Dan wordt dat licht verzameld en kan het naar elk soort optisch instrument worden gestuurd dat u kiest. Op dit moment sturen we het naar een kleine UV/Vis-spectrometer om een ​​volledig spectrum te krijgen."

Het instrument van de groep is, misschien, het best samengevat als een "werkpaardgereedschap". De eenvoudige concepten en componenten kunnen gemakkelijk worden aangepast voor veel verschillende doeleinden en eenvoudig en goedkoop aan bestaande microscopen worden toegevoegd.

"We wilden het voor één specifiek gebruik bouwen:om de spectrale verschuiving van fluorescerende indicatoren te meten, "Zei Hammond. "Toen we begonnen, hebben we er niet echt over nagedacht om het veelzijdig te maken of hoe we de SLM en polarisatoren moesten rangschikken. Maar we hadden onderweg een leuke reeks realisaties."

Een van die realisaties was dat hun instrument ook gebruikt kon worden voor absorptiemetingen.

"Vaak, de belangrijkste monsters zijn klein en moeilijk te maken of te zuiveren, zoals kristalvormen, " zei hij. "Het is zwaar werk om de twee soorten van elkaar te zuiveren in voldoende hoeveelheden om een ​​cuvet te vullen. Als je het mengsel op een microscoopglaasje legt, het wordt makkelijker. Kristallen kunnen één voor één worden gemeten, en dat geldt ook voor cellen die variabele chromoforen tot expressie brengen (moleculen die verantwoordelijk zijn voor kleur). Dit opent een heel nieuw gebied dat geen deel uitmaakte van ons oorspronkelijke plan."

Het instrument van de groep kan "het volledige spectrum van een of meer door de gebruiker gedefinieerde interessegebieden opnemen en tegelijkertijd standaard fluorescentiebeelden van het hele gezichtsveld vastleggen, "Zei Hammond. "Dus wat je ermee kunt doen, hangt af van het monster. We gebruiken het nu om fluorescerende sondes voor pH en calcium te volgen. Maar een voorbeeld van een heel andere toepassing is het vermogen om individuele micro-organismen in een gemengd monster te identificeren aan de hand van hun absorptievingerafdruk."

Wat volgt er voor de onderzoekers?

"Door een gepulseerde excitatiebron te gebruiken, de fluorescentie-levensduur van een sonde kan worden gemeten vanuit een geselecteerde regio van belang, " zei Hammond. "Een interessante potentiële toepassing is op het gebied van neurowetenschappen voor het oplossen van enkelvoudige actiepotentialen met kleurstoffen die gevoelig zijn voor membraanpotentiaal. Fluorescentie-levensduurmetingen bieden een voordeel ten opzichte van directe fluorescentiemetingen omdat ze onafhankelijk zijn van de concentratie van de sonde."