Door Tricia Lobo, bijgewerkt op 30 augustus 2022

Enzymen versnellen chemische reacties door de activeringsenergie te verlagen. De meeste enzymen presteren het beste tussen 35°C en 40°C, een bereik waar verhoogde kinetische energie de substraatbinding verbetert zonder denaturatie te veroorzaken. Het overschrijden van deze periode kan het eiwit onomkeerbaar ontvouwen en de activiteit stopzetten.

Stap 1:Kies een kwantitatieve test

Selecteer een betrouwbare methode om de productvorming op elk temperatuurpunt te kwantificeren. Veel voorkomende opties zijn onder meer spectrofotometrie (het omzetten van absorptie in concentratie met behulp van een kalibratiecurve) of fluorescentietesten die de intensiteit correleren met de hoeveelheid product.

Stap 2:Bereid het reactiesysteem voor

Combineer enzym en substraat in een afgesloten scintillatieflesje om verdamping te voorkomen. Plaats het flesje in een groter bekerglas met water en monteer het bekerglas op een verwarmingsplaat. Plaats een gekalibreerde thermometer in de beker om de temperatuur van de oplossing nauwkeurig te controleren.

Stap 3:Monsters nemen binnen het temperatuurbereik

Begin met het nemen van een aliquot van 100 µl bij omgevingstemperatuur (~25°C). Activeer de verwarmingsplaat en verzamel monsters van 100 µl bij oplopende temperaturen (30,5°C, 31°C, 31,5°C, enz.) tot een temperatuur van 40°C. Zorg ervoor dat elk monster onmiddellijk wordt verwerkt om temperatuurschommelingen te voorkomen.

Stap 4:Analyseer de productconcentratie

Bepaal de productconcentratie voor elk aliquot met behulp van de gekozen test. Zet de concentratie (of reactiesnelheid) uit tegen de temperatuur. De piek van deze curve identificeert de optimale temperatuur van het enzym. Temperaturen boven 40°C laten doorgaans een afname van de activiteit zien, wat wijst op het begin van denaturatie.

Benodigde materialen

• Enzym
• Substraat
• Producttestkit (spectrofotometrisch of fluorescerend)
• Scintillatieflesje met deksel
• Beker
• Verwarmingsplaat
• Gekalibreerde thermometer