Een nieuw systeem om genexpressiesignalen te versterken zou een game-changer kunnen zijn voor wetenschappers die de regulerende processen bestuderen in cellen die centraal staan ​​in al het leven.

Het Rice University-lab van biowetenschapper Laura Segatori heeft een veelzijdige gensignaalversterker ontwikkeld die de expressie van doelgenen beter kan detecteren dan de huidige methoden.

uiteindelijk, de onderzoekers hopen dat het systeem met twee modules de diagnose van ziekten zoals Alzheimer zal vereenvoudigen, diabetes en sommige vormen van kanker die worden gekenmerkt door onderscheidende patronen van eiwitexpressie. Ze zeiden dat het ook celgebaseerde therapieën mogelijk zou maken waarmee zieke cellen hun eigen medicijn kunnen maken op het moment dat ze dat nodig hebben.

Hun werk wordt beschreven in Natuur Chemische Biologie .

De eerste module maakt deel uit van een reeks synthetische genetische code die via CRISPR-Cas9-bewerking aan het DNA van een zoogdiercel wordt toegevoegd. Eenmaal geïntegreerd naast een doelgen, de code maakt een genetisch circuit mogelijk dat het gen controleert en, wanneer het gen een eiwit produceert, het circuit zendt ook een groen fluorescerend eiwit (GFP) uit. De schakeling is ontworpen om het GFP-signaal te versterken en detectie van zeer kleine veranderingen in het doelgen mogelijk te maken die met de huidige tools niet altijd mogelijk zijn.

Wanneer het gen inactief is, de tweede module, gebaseerd op een antilichaam dat voor het eerst in kamelen werd gevonden, stopt de productie van het fluorescerende eiwit en degradeert alle GFP's in de buurt. De combinatie geeft onderzoekers een sterk "aan-uit"-signaal dat ook gevoelig is voor de dynamiek van expressie van het doelgen. Wanneer genexpressie toeneemt, het circuit activeert de expressie van GFP en remt tegelijkertijd de expressie van negatieve regulatoren van GFP, zoals het nanolichaam.

"In staat zijn om genexpressie met hoge gevoeligheid te volgen, is erg belangrijk voor een verscheidenheid aan biomedische toepassingen, Segatori zei. "Het is belangrijk om een ​​detectiesysteem te hebben dat gevoelig is voor zelfs kleine veranderingen in genexpressie, die vaak biologisch relevant zijn. Het is ook van cruciaal belang voor een detectiesysteem dat een goede dynamische resolutie biedt, zodat we de dynamiek van genexpressie kunnen volgen, die typisch een belangrijke determinant zijn van celgedrag.

"Dat is wat onze gensignaalversterker in wezen doet, " zei ze. "We hebben een genetisch circuit ontwikkeld dat, Allereerst, we kunnen linken naar elk gen in het chromosoom, waardoor een tool wordt gegenereerd die de chromosomale context recapituleert met alle bijbehorende complexiteit van regulering. We hebben geen enkele vorm van extrachromosomale reporters. Deze benadering biedt een gevoelige manier om alle regulerende en epigenetische mechanismen te volgen die genexpressie reguleren.

"Vervolgens ontwikkelden we een methode om het signaal te versterken, zodat we heel kleine veranderingen in expressie kunnen volgen, " zei ze. "Het is zeer robuust en stabiel en heeft een hoge dynamische resolutie."

Het systeem kan worden aangepast om mogelijk elk cellulair gen te monitoren, zei Segatori. "We kunnen multiplex-reportersystemen creëren voor het bewaken van een groep genen die relevant zijn voor de ontwikkeling van een bepaalde ziekte of die een uitgebreide uitlezing bieden voor een bepaald signaalpad of fenotype, " ze zei.

Het team demonstreerde de methode op verschillende cellen en genereerde een multiplexreporter om markers te monitoren die geassocieerd zijn met drie signaalroutes die reageren op stress in het endoplasmatisch reticulum van een zoogdiercel. Ze ontdekten dat het circuit het fluorescerende signaal voldoende versterkte om zelfs kleine veranderingen in expressie te detecteren.

De tweede module, een NanoDeg-circuit geïntroduceerd door het Rice-lab in 2017, is een post-translation control die het systeem zijn brede dynamische bereik geeft, zei Segatori. "Onder basale omstandigheden, het circuit brengt niet alleen een transcriptionele regulator tot expressie die de expressie van GFP remt, maar ook NanoDeg-moleculen die elk in het systeem aanwezig GFP afbreken, dus de cel wordt helemaal donker, " zei ze. "En we kunnen het systeem afstemmen om het aan te passen aan de detectie van genen met verschillende basale expressie door geschikte doses induceerders van de circuitcomponenten te gebruiken."

Experimenten bevestigden dat de integratie van het systeem in het chromosoom van de cel de expressie van doelgenen niet beïnvloedt.

Als onderdeel van de studie, het lab ontwikkelde ook een wiskundig model dat onderzoekers kunnen gebruiken om het versterkerplatform aan te passen om elk doelgen te volgen en de optimale doses van kleine molecule-inductoren te voorspellen die worden gebruikt om genexpressie te reguleren.

Segatori en haar team werken aan het verbeteren van het platform, voornamelijk ontwikkeld door Rice afgestudeerde student en hoofdauteur Carlos Origel Marmolejo, ziekte te behandelen.

"Er is momenteel grote belangstelling voor het ontwikkelen van celtherapieën die reageren op feedback, "Zei Segatori. "Ons platform zou de productie van therapieën kunnen toestaan ​​als reactie op de detectie van genexpressiesignaturen die relevant zijn voor een bepaalde ziekte of omgevingsconditie."