Het begint klein, gewoon een huidvlek. De meest voorkomende moedervlekken blijven zo:onschadelijke clusters van huidcellen die melanocyten worden genoemd, die ons pigment geven. In zeldzame gevallen, wat begint als een moedervlek kan een melanoom worden, het meest ernstige type huidkanker bij de mens, omdat het zich door het hele lichaam kan verspreiden.

Wetenschappers gebruiken krachtige supercomputers om het mechanisme bloot te leggen dat celmutaties activeert die in ongeveer 50 procent van de melanomen worden aangetroffen. De wetenschappers zeggen hoopvol te zijn dat hun onderzoek kan helpen om huidkanker beter te begrijpen en om betere medicijnen te ontwikkelen.

In 2002, wetenschappers vonden een verband tussen huidkanker en mutaties van B-Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) kinase, een eiwit dat deel uitmaakt van de signaalketen die buiten de cel begint en naar binnen gaat om de celgroei te sturen. Dit signaalpad, de Ras/Raf/Mek/Erk-kinase-route genoemd, belangrijk voor kankeronderzoek, die probeert uit de hand gelopen celgroei te begrijpen. Volgens de studie, ongeveer 50 procent van de melanomen heeft een specifieke enkele mutatie op B-Raf, bekend als het valine 600-residu van glutamaat (V600E).

B-Raf V600E werd zo een belangrijk doelwit voor geneesmiddelen, en in de volgende jaren werden specifieke remmers van de mutant ontwikkeld. De medicijnen remden de mutant, maar er gebeurde iets vreemds. Paradoxaal genoeg, het stilleggen van de mutant had een keerzijde. Het activeerde het niet-gemuteerde, wildtype B-Raf-eiwitkinasen, die opnieuw melanoom veroorzaakte.

"Met deze achtergrond we hebben gewerkt aan het bestuderen van de structuur van dit belangrijke eiwit, B-Raf, " zei Yasushi Kondo, een postdoctoraal onderzoeker in het John Kuriyan Lab aan de UC Berkeley. Kondo is de co-auteur van een onderzoek van oktober 2019 in het tijdschrift Wetenschap die de structuur bepaalde van het complex van eiwitten waaruit B-Raf bestaat en ook vond hoe de paradoxale B-Raf-activering plaatsvindt.

"We wilden de meer native-achtige toestand van het eiwit bestuderen om te begrijpen hoe het in de cellen wordt gereguleerd, omdat de meeste onderzoeken zijn gericht op het geïsoleerde kinasedomein en hoe de medicijnen zich binden aan het kinasedomein", zei Kondo.

Het B-Raf-eiwit van volledige lengte is gemaakt van verschillende domeinen die zijn verbonden door ongeordende regio's, iets dat te onpraktisch is voor wetenschappers om zich nog een voorstelling te maken. Kondo's techniek was om inteïne-chemie te gebruiken om kleinere fragmenten te maken, naai ze dan op om de volledige structuur te krijgen.

"Als resultaat, we hebben een actieve vorm verkregen van het B-Raf-dimeer van volledige lengte, B-Raf genaamd, samen gezuiverd met 14-3-3-dimeer, een steigereiwit gebonden aan de gefosforyleerde B-Raf C-terminale staart, ' zei Kondo.

Kondo's groep gebruikte cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) om de structuur van het B-Raf 14-3-3-complex te bepalen, in feite cryogeen bevriezen van het eiwitcomplex, waardoor het in een chemisch actieve, bijna natuurlijke omgeving. Vervolgens flitsten ze het met elektronenstralen om duizenden 'freeze frames' te verkrijgen. Ze filterden achtergrondruis en reconstrueerden driedimensionale dichtheidskaarten die voorheen onbekende details in de vorm van het molecuul vertoonden. En voor eiwitten vorm volgt functie.

Kondo legde uit dat de structuur een asymmetrische organisatie van het complex onthulde, gevormd door twee sets van intern symmetrische dimeren, of paren gebonden moleculen. "We stellen voor dat deze onverwachte opstelling asymmetrische activering van het B-Raf-dimeer mogelijk maakt, wat een mechanisme is dat een verklaring geeft voor de oorsprong van de paradoxale activering van B-Raf door remmers van kleine moleculen, ' zei Kondo.

Gedetailleerde analyse van de asymmetrische B-Raf 14-3-3 complexe structuur toonde een ander onverwacht structureel kenmerk, beschreven als het distale staartsegment, DTS in het kort, van één B-Raf-molecule. Kondo zei dat de staart van de ene gebonden is aan de actieve plaats van de andere, het blokkeren van zijn activiteit door te concurreren met ATP-binding. Het geblokkeerde B-Raf-molecuul is gestabiliseerd in de actieve conformatie. "We interpreteerden deze structuur dat dit geblokkeerde B-Raf-molecuul functioneert als een activator en de andere B-Raf-ontvanger stabiliseert via de dimeerinterface, ' zei Kondo.

Vreemd genoeg, de auteurs vergelijken het B-Raf-dimeer met het Chinese yin-yang cirkelvormige symbool van onderling verbonden tegenpolen die aan de staart zijn verbonden. "Door naar het onderwerp te kijken, het is heel duidelijk dat men het stroomafwaartse molecuul niet kan fosforyleren, wat nodig is voor celgroei. Het andere molecuul is duidelijk degene die het werk moet doen. In deze set van twee moleculen, we zien duidelijk dat iemand het ondersteunende werk doet, en de ander doet het eigenlijke werk. Het lijkt echt op Yin en Yang in dit B-Raf 14-3-3 complex dat we hebben opgelost, ' zei Kondo.

ziet er uit, Hoewel, kan bedriegen. Wetenschappers gebruikten computersimulaties om te verifiëren dat ze echt iets op het spoor waren. "We hebben moleculaire dynamica-simulaties uitgevoerd van dit complex van het B-Raf-dimeer gebonden aan een 14-3-3-dimeer om de stabiliteit van de asymmetrische conformatie te testen, " zei co-auteur Deepti Karandur van de studie, ook een postdoctoraal onderzoeker aan het John Kuriyan Lab van UC Berkeley; ze is ook een postdoctoraal onderzoeker aan het Howard Hughes Medical Institute. "We wisten niet waarom de conformatie asymmetrisch was, of welke rol het speelde bij het handhaven van de actieve toestand van het enzym, ' zei Karandur.

Ze begonnen de simulaties met behulp van de structuur die Kondo had opgelost met cryo-EM, waarbij het DTS-segment van de ene kinase naar de actieve plaats van de andere loopt. Daarna voerden ze een tweede reeks simulaties uit waarbij het DTS-segment was verwijderd.

"Wat we vonden was dat in het systeem zonder het distale staartsegment, het hele complex is niet stabiel, " legde Karandur uit. "De kinasedomeinen bewegen ten opzichte van de steiger, het 14-3-3-dimeer. In een van onze simulaties de dimere toestand van B-Raf zelf, waarvan experimenten hebben aangetoond dat het nodig is om de actieve toestand van dit kinase te behouden, het viel uit elkaar, wat aangeeft dat dit distale staartsegment, DTS, nodig is om dit complex daadwerkelijk in deze asymmetrische conformatie te houden, wat op zijn beurt nodig is om het kinasedimeer in de stabiele asymmetrische actieve toestand van het dimeer te houden."

Een van de belangrijkste resultaten van het onderzoek was het vinden van het werkingsmechanisme dat het B-Raf-kinasecomplex van twee B-Raf-kinasen en twee 14-3-3-steigereiwitten activeert, waar op B-Raf kinase de activator is, en de andere is de ontvanger.

"De staart van het ontvangende molecuul bevindt zich in de actieve plaats van de activator, dus de activator kan niet werken als een enzym, ' zei Kondo. 'In plaats daarvan, het activatormolecuul stabiliseert de actieve conformatie van het ontvangende molecuul. Het 14-3-3 scaffold-eiwit vergemakkelijkt deze opstelling, zodat de staartinsertie slechts met één kinasemolecuul gebeurt. We veronderstellen dat wanneer er geen 14-3-3 binding is, beide kinasen kunnen worden geblokkeerd door het inbrengen van de DTS, maar dit moet worden getest."

De computationele uitdagingen van het onderzoek waren moleculaire dynamica-simulaties die het eiwit op atomair niveau modelleerden, het bepalen van de krachten van elk atoom op elk ander atoom voor een systeem van ongeveer 200, 000 atomen in tijdstappen van twee femtoseconden.

"Voor kleine systemen, we kunnen relatief snel zien wat er gebeurt, maar voor grote systemen als deze, vooral grote biomoleculaire systemen, deze veranderingen gebeuren op tijdschalen van nanoseconden, tijdschalen van microseconden, of zelfs milliseconden tijdschalen, ' zei Karandur.

Karandur en collega's wendden zich tot XSEDE, de door NSF gefinancierde Extreme Science and Engineering Discovery Environment, voor toewijzingstijd op de Stampede2-supercomputer in het Texas Advanced Computing Center (TACC) om de simulaties te doen, evenals het Bridges-systeem in het Pittsburgh Supercomputer Center om andere eiwitten in de route te onderzoeken. Stampede2's Skylake-processorknooppunten, genetwerkt met Intel Omnipath, maakte snel werk van de voor supercomputers geoptimaliseerde NAMD-simulaties van moleculaire dynamica.

"Stampede2 loopt erg, erg snel, en het is zeer efficiënt. We hebben in ongeveer vier tot zes weken in totaal ongeveer 1,5 microseconde aan trajecten voor onze systemen gegenereerd. Terwijl, als we het op ons eigen interne cluster hadden uitgevoerd, zou het ons maanden of langer hebben gekost, ' zei Karandur.

Over XSEDE, Karandur merkte op:"Ik vind het een geweldige bron. Ik heb simulaties uitgevoerd vanaf mijn afstuderen. XSEDE maakte het voor ons mogelijk om toegang te krijgen tot tijdschalen die biologisch relevant zijn. Alles wat er in een cel gebeurt, gebeurt op microseconden tijdschalen, naar milliseconden tijdschalen, tot langer. Toen ik begon, we konden deze simulatie nergens op een systeem uitvoeren. Ik bedoel, het zou vijf jaar hebben geduurd, of meer. Om het in weken te kunnen doen en te zeggen, Oke, we weten waarom dit belangrijk is, zodat we nu echt inzicht kunnen krijgen in hoe de biologie gebeurt, is gewoon geweldig, ' zei Karandur.

En er valt nog veel te ontdekken over B-Raf. Het is slechts één schakel in de signaalketen die celgroei en kanker regelt.

"De structuur die in dit document is opgelost, maakt deel uit van een groot, systeem met meerdere domeinen, " legde Karandur uit. "We weten niet hoe dit complete eiwit eruit ziet. We zien het niet in de structuur. We weten niet hoe de dynamiek eruit ziet, en hoe al deze andere delen van het eiwit een rol spelen bij het in stand houden van de actieve toestand, of het omzetten van de inactieve staat naar de actieve staat."

Ze vervolgde dat naarmate het systeem groter wordt, de relevante structurele veranderingen gebeuren over langere tijdschalen, en er zijn grotere supercomputers nodig om de complexiteit aan te kunnen, zoals de door NSF gefinancierde Frontera-supercomputer, ook bij TAC.

"Frontera komt er. We zijn hier erg enthousiast over. We zijn bezig met het verkrijgen van een toewijzing voor Frontera, ' zei Karandur.

Voor niet-wetenschappers, dit fundamentele onderzoek zou inzichten kunnen opleveren die leiden tot betere medicijnen tegen huidkanker.

"De paradoxale activering van Raf-kinase door deze B-Raf-specifieke remmers verandert normale cellen in tumoren tijdens de behandeling van huidkanker, "Zei Kondo. Als we het mechanisme van dit fenomeen begrijpen, kunnen we betere medicijnen ontwerpen. Hopelijk, onze studie kan bijdragen aan het begrip van deze stap. In aanvulling, we vonden mutaties in deze link tussen het kinase-domein en het 14-3-3-bindende element van het B-Raf-molecuul, die nooit eerder vertoond was. Deze mutatie vermindert de activiteit van B-Raf in de cellen. Het geeft ook aan dat dit deel van het kinasedomein een doelwit kan zijn om nieuwe soorten B-Raf-remmers te ontwikkelen."

Zei Karandur:"Er is veel dynamiek in de cel. We zijn, grotendeels dankzij XSEDE, begin dat soort dingen pas te zien. Vooruit gaan, de enige manier waarop we naar de dingen kunnen blijven kijken, is door zeer, zeer grote supercomputers, omdat de berekeningen veel rekenkracht vergen. Het is echt opwindend om deze dingen echt te zien gebeuren en te zeggen:hier zijn hoe dingen veranderen op atomair niveau; hier zijn deze interacties tussen deze twee atomen, ontstaan ​​of breken, en dat vertaalt zich in deze enorme verandering op mondiaal niveau in de algehele structuur van het eiwit, en hoe het interageert met andere eiwitten, of andere moleculen in de cel. We zijn erg enthousiast over waar het in de toekomst naartoe zal gaan."

De studie, "Cryo-EM-structuur van een dimeer B-Raf:14-3-3-complex onthult asymmetrie in de actieve plaatsen van B-Raf-kinasen, " werd op 4 oktober gepubliceerd, 2019 in het journaal Wetenschap .