Onderzoekers van het Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley Lab) en de University of California, Berkeley heeft geavanceerde cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) gecombineerd met computationele moleculaire modellering om een ​​bijna atomair-resolutiemodel te produceren van de interactie tussen microtubuli - cruciale componenten van de ultrastructuur van eukaryote cellen - en met microtubuli geassocieerde eiwitten die tau worden genoemd.

Het model geeft inzicht in hoe tau microtubuli stabiliseert, en wat maakt het dissociëren om tau-aggregaten te vormen, of "klitten, " bij sommige neurologische ziekten - waaronder de ziekte van Alzheimer - die in het algemeen tauopathieën worden genoemd.

Microtubuli spelen een belangrijke rol bij het in stand houden van de celvorm, het mogelijk maken van bepaalde vormen van voortbeweging, vergemakkelijken van intracellulair transport, en het scheiden van chromosomen tijdens mitose. Elke microtubule is een holle cilinder die is samengesteld uit dertien parallelle protofilamenten van tubuline-eiwit.

Tau helpt microtubuli stabiel te houden en organiseert ze in bundels. Mutaties of post-translationele modificaties, zoals hyperfosforylering, die de affiniteit van tau voor microtubuli verminderen, worden verondersteld bij te dragen aan de vorming van tau-kluwens.

Het team, onder leiding van Eva Nogales, een senior faculteitswetenschapper in de Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging (MBIB) Division bij Berkeley Lab en een Howard Hughes Medical Institute-onderzoeker en professor aan UC Berkeley, gebruikte cryo-EM om native volwassen tau van volledige lengte af te beelden, gebonden aan microtubuli met een algehele resolutie van 4,1 A?. Ze toonden aan dat tau longitudinaal hecht langs de top van de tubulinefilamenten, een bevinding die consistent is met een eerdere cryo-EM-studie met lage resolutie.

Tau is een intrinsiek ongeordend eiwit dat een projectiedomein omvat, een microtubule-bindend gebied van vier imperfecte sequentieherhalingen, en een C-terminaal domein. Tubuline is een dimeer, wat een samengevoegd paar nauw verwante polypeptiden betekent, in dit geval α-tubuline en β-tubuline. De tubuline-dimeren worden kop aan staart aan elkaar geregen (of polymeriseren) om de protofilamenten te vormen die deel uitmaken van microtubuli.

"Gezien de uitgebreide literatuur over het gebrek aan regelmatige structuur, we waren er niet zeker van dat tau daadwerkelijk geordende interacties zou aangaan met tubuline, " zei Elizabeth Kellogg, een postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Nogales en co-eerste auteur van de paper die het werk presenteert, gepubliceerd op 10 mei in het tijdschrift Wetenschap .

Om hypothesen te testen over welke tau-residuen betrokken zijn bij binding aan tubuline, ze creëerden vervolgens synthetische tau-constructen met microtubule-bindende regio's bestaande uit vier identieke herhalingen en beeldden die ook af die aan microtubuli waren bevestigd (algemene resolutie 3,2-3,9 ). Simon Poepsel, een postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Nogales, had als afgestudeerde student met de amyloïde vorm van tau gewerkt en speelde een belangrijke rol bij het zuiveren en voorbereiden van de monsters voor cryo-EM.

"Toen we eindelijk in staat waren om de lengte van een tau-herhaling te zien en te zien dat het een gedefinieerde structuur en bindingsplaats had, we realiseerden ons dat tau in feite specifieke interacties aanging met het tubuline-oppervlak, zei Kellogg. "Toen we dat konden verzoenen met de lengte van een herhaling en de volgorde-informatie die we hadden, het was de sleutel die we nodig hadden om erachter te komen hoe we de reconstructies voldoende konden verbeteren om atomaire modellering mogelijk te maken."

Het team wendde zich toen tot Rosetta, een uitgebreide reeks computationele modelleringstools voor het voorspellen van de driedimensionale atomaire structuren van macromoleculen op basis van informatie over de aminozuursequentie, gebaseerd op de conformatie met de laagste energietoestand. Dankzij de cryo-EM-kaarten met hoge resolutie kon het team beperkingen opleggen aan de algemene vorm van het moleculaire complex, het vergroten van de betrouwbaarheid van het model, Nogales legde het uit.

Frank DiMaio, an associate professor in department of biochemistry and the Institute for Protein Design at the University of Washington, contributed his expertise working with the Rosetta platform, particularly the "fit to density" function using cryo-EM data.

Rosetta structure predictions for two different synthetic tau constructs converged on the same solution:a backbone stretch of 27 residues spanning three tubulin monomers. "The identical sequence register and atomic details from two independent maps underscores the robustness of our solution and provides high confidence in the accuracy of our atomic models, " Nogales said.

"Our structure shows how tau's main contact with the microtubule surface is at the interface between tubulin subunits, serving as a 'stapler' to promote the association between tubulin subunits and explaining how tau promotes microtubule stability, " said Kellogg. "The structure also explains how tau phosphorylation leads to its dissociation from microtubules."

Phosphorylation of the serine at position 262 (universally conserved among tau repeats) has been observed to attenuate microtubule binding and is a marker of Alzheimer's disease. The model shows that phosphorylation at this crucial anchor point would disrupt interaction between tau and the microtubule and thus cause the "staples to fall off". Additional residues that are critical for tau-microtubule binding were identified as well.