science >> Wetenschap >  >> Chemie

Een biosensor voor het meten van extracellulaire waterstofperoxideconcentraties

Figuur 1:(a) Verklarende schets van de plasmamembraan verankerde nanosensor. De verbindingen die worden gebruikt voor de conjugatie van gouden nanodeeltjes (AuNP) zijn de H2O2-gevoelige 4-mercaptofenylboron-pinacolester (4MPBE) en biotine-HPDP. Biotinylering van de plasmamembraaneiwit-ectodomeinen wordt verkregen met behulp van NHS-Biotine. De verankering van het geconjugeerde AuNP en NHS-Biotine wordt gegeven door streptavidine dat reageert met de twee biotineresten. ( b ) AFM-analyse werd uitgevoerd op A549-longkankercellen na verankering en fixatie van nanosensoren. AFM-beelden met hoge resolutie bevestigden de aanwezigheid van de nanosensor, die in contact staat met het celoppervlak en in staat is om endogeen H2O2 te detecteren in een zeer ondiep gebied (d.w.z. 90 nm) van de extracellulaire vloeistof in contact met het plasmamembraan. Krediet:Kanazawa University

Onderzoekers van Kanazawa University rapporteren in Biosensoren en bio-elektronica een succesvolle test van een sensor voor het meten van waterstofperoxideconcentraties nabij celmembranen. De sensor heeft de potentie om een ​​hulpmiddel te worden voor nieuwe kankertherapieën.

Verschillende processen in het menselijk lichaam worden gereguleerd door biochemische reacties met waterstofperoxide (H 2 O 2 ). Hoewel het kan fungeren als een 'secundaire boodschapper, " doorgeven of versterken van bepaalde signalen tussen cellen, H 2 O 2 is over het algemeen giftig vanwege het oxiderende karakter. Dat laatste betekent dat het biochemische moleculen zoals eiwitten en DNA omzet (oxideert). De oxiderende eigenschap van H 2 O 2 is van potentieel therapeutisch belang voor kanker, hoewel:opzettelijk ervoor zorgen dat tumorcellen hun H . verhogen 2 O 2 concentratie zou een manier zijn om ze te vernietigen. In het licht hiervan, maar ook voor het bewaken van pathologieën geassocieerd met H 2 O 2 overproductie, het is van cruciaal belang om een ​​middel te hebben om de waterstofperoxideconcentraties in de extracellulaire omgeving betrouwbaar te kwantificeren. Nutsvoorzieningen, Leonardo Puppulin van het Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), Kanazawa University en collega's hebben een sensor ontwikkeld voor het meten van concentraties H 2 O 2 in de buurt van celmembranen, met nanometer-resolutie.

De biosensor bestaat uit een gouden nanodeeltje waaraan organische moleculen zijn bevestigd. Het hele cluster is zo ontworpen dat het gemakkelijk aan de buitenkant van het celmembraan kan worden verankerd, dat is precies waar de waterstofperoxidemoleculen zijn die moeten worden gedetecteerd. Als aanhechtingsmoleculen, de wetenschappers gebruikten een verbinding genaamd 4MPBE, waarvan bekend is dat ze een sterke Raman-verstrooiingsrespons hebben:wanneer bestraald door een laser, de moleculen verbruiken een deel van de energie van het laserlicht. Door de frequentieverandering van het laserlicht te meten, en het plotten van de signaalsterkte als functie van deze verandering, een uniek spectrum wordt verkregen - een handtekening van de 4MPBE-moleculen. Wanneer een 4MPBE-molecuul reageert met een H 2 O 2 molecuul, het Raman-spectrum verandert. Op basis van dit principe, door Raman-spectra te vergelijken, Puppulin en collega's waren in staat om een ​​schatting te krijgen van de H 2 O 2 concentratie in de buurt van de biosensor.

Figuur 2:(a) Oppervlakteversterkte Raman-spectroscopie werd gebruikt om de H2O2-geïnduceerde modificatie van 4MPBE-moleculen die zijn geassembleerd op het gouden oppervlak van de nanosensor die aan de cellen is verankerd, te detecteren en te kwantificeren. De intensiteit van de Raman-band bij 998 cm-1 hangt af van de H2O2-concentratie, terwijl de band bij 1074 cm-1 geen wijziging vertoonde en deze kan worden gebruikt voor normalisatie van de spectraallijnen. (b) Resultaten van de kalibratie van de nanosensor. De verhouding van de intensiteit bij 1074 cm-1 tot de intensiteit bij 998 cm-1 vertoonde lineaire afhankelijkheid met betrekking tot de H2O2-concentratie. (c) Voorbeeld van een SERS-hyperspectrale kaart van extracellulair endogeen H2O2 verzameld vanaf het oppervlak van de A549-cel getoond in de helderveldbeeld. De SERS-spectra getoond in (a) zijn verzameld op de locaties A en B. Credit:Kanazawa University

Na het ontwikkelen van een kalibratieprocedure voor hun nanosensor - met betrekking tot de H 2 O 2 concentratie tot een kwantitatieve verandering in het Raman-spectrum is niet eenvoudig - de wetenschappers waren in staat om een ​​concentratiekaart te maken met een resolutie van ongeveer 700 nm voor longkankercelmonsters. Eindelijk, ze slaagden er ook in hun techniek uit te breiden om metingen van de H . te verkrijgen 2 O 2 concentratievariatie over celmembranen.

Puppulin en collega's concluderen dat hun "nieuwe benadering nuttig kan zijn voor de studie van de werkelijke H 2 O 2 concentraties die betrokken zijn bij celproliferatie of dood, die fundamenteel zijn om fysiologische processen volledig op te helderen en om nieuwe therapeutische strategieën te ontwerpen."

Figuur 3:(a) Verklarend schema van de extracellulaire productie van H2O2 door NOX-complex, de daaruit voortvloeiende absorptie via het Aquaporin-kanaal en de reactie met intracellulair peroxiredoxine. Bij stationaire toestand, de concentratieverhouding van extracellulair H2O2 tot intracellulair H2O2 kan worden geschat door de verhouding van de snelheidsconstante van H2O2-reductie door peroxiredoxine (kprx) tot de snelheidsconstante van H2O2-absorptie door het plasmamembraan (kabs). (b)-(c) Typische resultaten van redoxbiologie-experimenten met paslijnen waaruit we kabs en kprx hebben gemeten, respectievelijk. (d) Gemiddelde extracellulaire oppervlakte [H2O2]e en het typische maximum van [H2O2]e gemeten op A549-cellen met behulp van de nieuw ontworpen nanosensor. (e) Gemiddelde intracellulaire [H2O2]i en het typische maximum van [H2O2]i geschat op A549-cellen volgens het model gerapporteerd in (a) en gebruikmakend van de resultaten van (b)-(d). Krediet:Kanazawa University

De biosensor ontwikkeld door Leonardo Puppulin van Kanazawa University en collega's is gebaseerd op een methode die oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) wordt genoemd. Het principe is afgeleid van Raman-spectroscopie, waarin verschillen tussen de inkomende en de uitgaande frequenties van laserlicht dat op een monster wordt gestraald, worden geanalyseerd. Het spectrum dat wordt verkregen door de signaalsterkte uit te zetten als functie van het frequentieverschil is kenmerkend voor het monster, die in principe een enkel molecuul kan zijn. Typisch, echter, het signaal afkomstig van één molecuul is te zwak om te detecteren, but the effect can be enhanced when the molecule is absorbed on a rough metal surface. Puppulin and colleagues applied the technique to (indirectly) detect hydrogen peroxide; their Raman-responsive molecule is a compound called 4MPBE, which is modified when exposed to hydrogen peroxide.