"Wat we hier doen, is eigenlijk de binding van de piek aan ACE 2 [angiotensine-converterend enzym 2] visualiseren, ", zegt Kirill Gorshkov, een onderzoekswetenschapper bij het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) in Maryland, ONS.

Hoe onschuldig dit ook mag klinken voor niet-ingewijden, deze binding is de eerste stap in een proces van virale proliferatie dat mogelijk heeft geleid tot de ergste pandemie sinds mensenheugenis. De "spike" is een eiwit op het SARS-CoV-2-virus dat algemeen wordt erkend als het primaire aanvalswapen voor het mobiliseren van zijn virale DNA in een gastheercel. De ACE2-receptoren zijn menselijke celeiwitten die effectief de deur openen voor deze aanval. Met behulp van bio-engineered quantum dots, Gorshkov en Eunkeu Oh bij het Naval Research Laboratory (NRL) in Washington, gelijkstroom, en hun collega's waren in staat om de binding en daaropvolgende internalisatie in beeld te brengen die plaatsvindt wanneer ACE2 en het spike-eiwit op elkaar inwerken. "Je kunt dat in realtime zien gebeuren, " voegt Gorshkov toe, "Dat is het mooie van deze test en daarom denken we dat het belangrijk zal zijn voor de screening van geneesmiddelen."

Een virus kan zich niet voortplanten zonder een gastheercel in te schrijven, daarom hebben onderzoekers over de hele wereld gewerkt om te begrijpen hoe SARS-CoV-2 interageert met en cellen binnendringt met als doel dit stadium te blokkeren en het begin van COVID19 te voorkomen. Gorshkov en zijn collega's bij NCATS werkten al aan verschillende beeldvormende tests voor kanker, virussen en lysosomale stapelingsziekten, "maar toen het coronavirus toesloeg, we moesten snel schakelen, ', zegt Gorshkov.

Voorafgaand SARS-onderzoek had het belang benadrukt van interacties met ACE2 in menselijke cellen voor de verspreiding van dit soort virus, en ze waren al in staat om deze receptoreiwitten te taggen met een groen fluorescerend eiwit om hun bewegingen in beeld te brengen. Er stapelden zich ook bewijzen op om de specifieke spike-eiwitten op SARS-CoV-2 te lokaliseren die ACE2 in een bolwerk zouden kunnen opsluiten, zodat het virus de cel kan binnendringen. Echter, informatie over interacties met spike-eiwitten is meestal indirect verkregen uit biochemische of nabijheidstesten en tests met eiwitten en delen van eiwitten die uit het virus zijn gehaald - 'pseudo-viro-deeltjes'. Zonder fluorescerende labeling van deze virale eiwitten, hun rol in de ACE2-receptorbinding en daaropvolgende internalisatie - endocytose - bleef effectief spelen onder dekking van de duisternis voor beeldvorming.

Bij NRL, onderzoekers wilden ook graag gebruikmaken van hun expertise met nanodeeltjes voor cellulaire levering en biosensing om te helpen bij het zoeken naar anti-COVID19-medicijnen. Oh begon te kijken naar mogelijke manieren om de eiwit-nanostructuur-conjugatietechnieken toe te passen waarmee ze al meer dan 15 jaar werkte. Met twee eiwitten die een bindingsaffiniteit delen - een kwantumdot die aan de ene is bevestigd en een fluorescerend nanodeeltje dat aan de andere is bevestigd - zal binding tussen de twee eiwitten de nanostructuren dicht genoeg bij elkaar brengen voor energieoverdracht tussen hen.

De resulterende fluorescentiedoving stelt de onderzoekers vervolgens in staat om de eiwitbinding te volgen. "Als je een remmer in het midden hebt om de binding te stoppen, dit kan worden gebruikt als een remmingstest voor het screenen van geneesmiddelen, dus we gebruiken dit veel, " legt Oh uit. Gezien de mogelijke toepassing voor het screenen van antilichamen tegen COVID19, Oh en haar team onder leiding van Mason Wolak presenteerden hun ideeën aan het team van NCATS, en de twee instellingen gingen direct aan de slag om het verder te ontwikkelen.

Een "pseudovirion" ontwikkelen

De eerste stap van Oh's kant van de samenwerking was het ontwikkelen van een "pseudovirion" met de krachtige delen van SARS-CoV-2 spike-eiwitten (waar het receptorbindende domein zich bevindt) op een zodanige manier aan de kwantumdot bevestigd dat de spike-eiwitten blijven cellen aanvallen en binnendringen, net als een actief virus. Voor deze, de oriëntatie van de spike-eiwitten en de vorm van het pseudovirion waren de sleutel, en hier, Oh's uitgebreide ervaring met het conjugeren van actieve eiwitten aan nanostructuren heeft zijn vruchten afgeworpen. Voordat we verder gaan met de duurdere cellulaire leveringstests, ze moesten testen of hun pseudovirion buiten de cellen functioneerde door fluorescerende gouden nanodeeltjes te conjugeren aan de ACE2-receptoren en te controleren op uitdoving van de fluorescentie. Oh somt de meerdere verhoudingen op van eiwit tot kwantumpunt, kwantumdotgroottes en oppervlaktechemie die ze probeerden voordat ze eindelijk in staat waren om fluorescentie-uitdoving op eiwitbinding waar te nemen, en waren klaar om het pseudovirion naar het team van Gorshkov te sturen "om coole dingen te doen met de echte cel."

Om het pseudovirion te observeren dat interactie aangaat met ACE2 in een echte cel, de kwantumstip op het pseudovirion moest nu worden ontworpen om te emitteren op een golflengte die gemakkelijk te onderscheiden was van het groene fluorescerende eiwit op ACE2, in tegenstelling tot het optimaliseren van het uitdoven van nanodeeltjes. Met de twee duidelijke signalen, het team van NCATS kon de binding van de twee eiwitten en daaropvolgende endocytose volgen. Aanvullend, ze konden zien dat de binding en endocytose werd voorkomen in de aanwezigheid van twee testantilichamen. Ze zouden zelfs het endocytosemechanisme kunnen testen, die verloopt door middel van een eiwit genaamd dynamin. Toen ze Dyngo-4a toevoegden, die de dynamiek onderbreekt, ze konden zien dat de binding plaatsvond, maar geen daaropvolgende endocytose.

De resultaten zijn ook een succes voor onderzoekssamenwerkingen op afstand, omdat de teams elkaar nooit echt hebben ontmoet. "Het soort samenwerking dat we hier hebben is zeldzaam, " zegt Gorshkov, weerspiegeld hoeveel hun vooruitgang eerdere samenwerkingen overtrof waar er een groter aantal fysieke vergaderingen en gecoördineerde activiteiten waren geweest. "Er was zo'n drive en zo'n focus van beide groepen dat het echt heel goed samenwerkte."

Het kwantumdot-pseudovirion is beperkt tot beeldvorming van celpenetratie door endocytose, en het moet nog worden bepaald of dit mechanisme van kracht wordt voor alle celtypen, longweefsel in het bijzonder. Een alternatief SARS-CoV-2 aanvalsmechanisme is gebaseerd op membraanfusie, en het afbeelden hiervan met het kwantum-dot pseudovirion zou aanzienlijke aanpassingen vereisen om meer als een membraan met de cel te interageren. Echter, de snelle doorvoer en directe waarnemingen die het quantum-dot pseudovirion mogelijk maakt, zouden aanzienlijke voordelen moeten opleveren bij het zoeken naar antilichamen.

© 2020 Wetenschap X Netwerk