Door Pete Collins | Bijgewerkt op 30 augustus 2022

TL;DR

Elektroforese scheidt macromoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren op grootte, lading en andere fysisch-chemische eigenschappen. Bij op lading gebaseerde scheidingen brengt een bufferoplossing het elektrische veld over en handhaaft een stabiele pH, waardoor de oorspronkelijke lading en structuur van de analyten behouden blijven. Deze stabiliteit is van cruciaal belang voor een nauwkeurige resolutie.

Principes van elektroforese

Elektroforese maakt gebruik van een aangelegd elektrisch veld (of een chemische gradiënt in gespecialiseerde technieken) om geladen moleculen door een gelmatrix te bewegen. Moleculen migreren naar de elektrode met tegengestelde lading:negatief geladen soorten reizen naar de anode, positief geladen soorten naar de kathode. Omdat grotere moleculen meer wrijving ervaren in de gel, bewegen ze langzamer dan kleinere, waardoor scheiding op basis van grootte mogelijk is. De gemigreerde afstand kan op een logaritmische schaal worden uitgezet om het molecuulgewicht of de fragmentlengte te schatten.

Denaturerende gradiëntgelelektroforese (DGGE)

DGGE introduceert een denaturerende gradiënt – doorgaans een mengsel van ureum en formamide – in de gel. Terwijl DNA-fragmenten de gradiënt doorkruisen, destabiliseren toenemende concentraties van denaturant geleidelijk de dubbele helix. Elk fragment stopt met migreren zodra de lokale concentratie van het denatureringsmiddel zijn smeltpunt bereikt. Deze techniek maakt gebruik van sequentie-afhankelijk smeltgedrag om DNA-fragmenten van identieke lengte maar met een verschillende sequentie op te lossen.

Wat de buffer doet

Bij op lading gebaseerde elektroforese geleiden de ionische soorten van de buffer het aangelegde elektrische veld door de gel, waardoor een uniforme stroomverdeling wordt gegarandeerd. Tegelijkertijd handhaaft het zwakke zuur-basepaar van de buffer de pH binnen een smal venster. Omdat de ladingstoestand en de driedimensionale structuur van eiwitten en nucleïnezuren pH-afhankelijk zijn, voorkomt een stabiele pH onbedoelde conformationele veranderingen die de scheidingsgetrouwheid in gevaar zouden kunnen brengen.

Typische buffers

Het kiezen van de juiste buffer hangt af van het gewenste pH-bereik en de noodzaak om de ionensterkte te minimaliseren, die anders overmatige hitte en vervorming zou kunnen veroorzaken. Veelgebruikte buffers zijn onder meer:

• Azijnzuur (pKa 4,76) – ideaal voor scheidingen met een lage pH.
• Boorzuur (pKa 9,24) – vaak gebruikt in op DNA gebaseerde tests.
• Fosforzuur (pKa 2,15, 7,20, 12,32) – veelzijdig voor een breed pH-spectrum.
• Citroenzuur (pKa 3,13, 4,76, 5,49) – zorgt voor buffering in het pH-bereik van 3–6.
• Glycine (pKa 2,34, 9,60) – gebruikelijk in Tris-glycinesystemen.
• Taurine (pKa 1,71) – gebruikt in gespecialiseerde elektroforetische protocollen.

Voor optimale prestaties moet de pKa van de buffer dicht bij de doel-pH liggen en moet de algehele ionensterkte laag genoeg zijn om de door stroom veroorzaakte opwarming te beperken, terwijl toch een efficiënte ladingsoverdracht mogelijk is.

Door zorgvuldig bufferomstandigheden te selecteren en te behouden, kunnen onderzoekers reproduceerbare scheidingen met hoge resolutie bereiken die essentieel zijn voor downstream-analyses.