Het transmembraaneiwit 206, afgekort als TMEM206, is een evolutionair geconserveerd chloridekanaal dat ten grondslag ligt aan het alomtegenwoordige, proton-geactiveerd, uiterlijk corrigerende anionstromen. In een nieuw rapport dat nu is gepubliceerd op wetenschappelijke vooruitgang , Zengqin Deng en een multidisciplinair onderzoeksteam aan de Washington University School of Medicine, in Saint-Louis, US beschreef de cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structuur van de kogelvis TMEM206. De structuur vormde een trimeer kanaal met twee transmembraansegmenten en een groot extracellulair domein. Volgens de resultaten, Deng et al. liet zien hoe een ruime vestibule in het extracellulaire gebied zijdelings toegankelijk was vanaf drie zijportalen, waar de centrale porie meerdere constructies bevatte. Bijvoorbeeld, een geconserveerd lysineresidu dichtbij het cytoplasmatische gebied van de binnenste helix, vermoedelijk vormde het chloride-ionselectiviteitsfilter. De kernstructuur en samenstelling leken op die van natriumkanalen die niet verwant zijn in aminozuursequentie, en geleiden daarom kationen in plaats van anionen. Samen met elektrofysiologie leverden ze inzichten op over ionengeleiding en gating voor een nieuwe klasse van chloridekanalen die architectonisch verschillend zijn van eerder beschreven chloridekanaalfamilies.

Chloride-ionkanalen

Chloride-ionen zijn overvloedige anionen bij dieren, en ze bewegen door celmembranen via chloridekanalen en transporters voor een verscheidenheid aan cellulaire functies, inclusief celvolumeregulatie, intracellulaire verzuring en prikkelbaarheid controle in spieren. De ionen worden op grote schaal waargenomen in zoogdiercellen, hoewel de moleculaire componenten achter de chloridestromen tot nu toe ongrijpbaar zijn gebleven. Twee onafhankelijke onderzoeken die genoombrede RNA-interferentiescreening gebruikten, hadden TMEM206 geïdentificeerd als het onderliggende anionkanaal. De TMEM206 is evolutionair geconserveerd in gewervelde dieren. Chloridekanalen zijn divers in zowel aminozuursequentie als driedimensionale architectuur. In dit werk, Deng et al. presenteerde een cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) structuur van kogelvis TMEM206 om een ​​trimere kanaalarchitectuur te onthullen die verschilt van de eerder bekende. De wetenschappers combineerden elektrofysiologie met dit werk om de eerste structurele en functionele beschrijving te geven van een evolutionair geconserveerd en breed uitgedrukt chloridekanaal om een ​​moleculair raamwerk te creëren en chloridegeleiding en kanaalgating te begrijpen.

De onderzoekers gebruikten groen fluorescerende eiwit-gelabelde constructies om TMEM206-kandidaten te identificeren en selecteerden kogelvissen TMEM206 vanwege hun 50 procent gedeelde sequentie-identiteit met het menselijke chloridekanaal. Deng et al. vervolgens het wildtype kogelvis TMEM206-eiwit van volledige lengte gezuiverd en onderworpen aan cryo-EM-analyse met één deeltje. Met behulp van 3D-reconstructiekaarten, ze onthulden een trimere kanaalarchitectuur met transmembraan- en extramembraandomeinen. De TMEM206 vormde een symmetrisch trimeer, waarbij elke subeenheid een transmembraandomein (TMD) bevatte met twee membraanoverspannende helices genaamd TM1 en TM2 en een groot extracellulair domein (ECD) verrijkt met β-domeinen met extra motieven die verder zijn georganiseerd in de bovenste en onderste lagen. Aanvullend, uitgebreide zijketencontacten waren betrokken via van der Waals-interacties in de binnenste en buitenste domeinen. Het trimere kanaalsamenstel introduceerde drie laterale openingen of zijportalen in het midden van het extracellulaire gebied om waarschijnlijk de doorgang van ionen en water te vergemakkelijken. De langwerpige zijportalen strekten zich uit tot de ECD-TMD-kruising om de nauwe verpakkingsinteracties te hervatten. Om technische moeilijkheden bij het bepalen van de structuur van het eiwit te overwinnen, Deng et al. fuseerde het C-uiteinde van door bot beperkt interferon-geïnduceerd transmembraanachtig eiwit (afgekort BRIL); een eiwit met vier helixen dat op grote schaal wordt gebruikt als chaperonne voor kristallisatie om de membraanstabiliteit te verbeteren en kristalvorming te bevorderen.

Ionenpermeatieroute en mutagenesestudies

Met behulp van poriestraalberekeningen, Deng et al. toonde aan hoe de centrale ionengeleidingsporie meerdere vernauwingen bevatte om ionenpassage te voorkomen. De structuur vertegenwoordigde niet-geleidende conformatie vanwege de hoge pH-bufferomstandigheden (pH 8,0) die werden gebruikt om de cryo-EM-structuur te bepalen. De omvangrijke en langwerpige centrale vestibule was lateraal toegankelijk vanwege het ontbreken van eiwit-eiwitcontacten in het extracellulaire domein. Het smalle punt van het eiwitkanaal interfereerde niet met ionengeleiding en kon worden gehandhaafd tijdens de kanaalpoortcyclus terwijl ionen door de drie zijportalen gingen. De licht positieve elektrostatische potentiaal van de binnenwanden van de centrale vestibule en zijingangen vergemakkelijkte ook de aantrekking van chloride-ionen. Op de extracellulaire domein-transmembraandomein (ECD-TMD) kruising, drie strengen verbonden met de buitenste helices en naar binnen bewogen om de binnenste helices samen te voegen om een ​​extracellulaire poort boven de bilipidelaag te genereren. Opeenvolgende constructies op de porie-gerichte posities vormden een hydrofobe poort die ionengeleiding zou kunnen verhinderen.

Om de structurele bevindingen te ondersteunen, Deng et al. voerde mutagenesestudies uit op belangrijke poriënlevende residuen. Wanneer ze de geconserveerde basische residuen vervangen door alanine of zure residuen, de door zuur geactiveerde chloridestromen werden afgeschaft. In tegenstelling tot, arginine-substituties behielden de kanaalfunctie om de vereiste van positieve ladingen in het anion-selectieve filter verder te ondersteunen. Bijvoorbeeld, het I310-domein vormde een kritische component van de transmembraanpoort en een andere structuur die bekend staat als K320 vormde het anionselectiviteitsfilter. Het werk ondersteunde structurele instandhouding tussen de orthologen van de mens en kogelvissen om een ​​fysiologisch relevant model voor chloridekanalen te vertegenwoordigen.

structurele convergentie

de topologie, structuur en assemblage van TMEM206 vertegenwoordigden die van de epitheliale natriumkanaal (ENaC) / degenerine-superfamilie van ionkanalen, inclusief zuurgevoelige ionenkanalen (ASIC's); ondanks een gebrek aan duidelijke aminozuursequentiehomologie tussen de twee kanalen. De trimere kanalen voor tegengesteld geladen natrium- en chloride-ionen, deelden niettemin een gemeenschappelijke kernstructuur geflankeerd door twee transmembraanhelices. Het team merkte op hoe de extracellulaire poort tussen de centrale vestibule en de transmembraanporie kan worden uitgebreid om ionen door te laten na kanaalactivering. Hoewel epitheliale natriumkanalen kunnen worden geactiveerd door remmende peptiden vrij te geven via proteolyse in het extracellulaire domein, de ASIC's en TMEM206 konden alleen worden geactiveerd door extracellulaire protonen. De geconserveerde structurele kenmerken tussen TMEM en AS1CS suggereerden ook analoge gating conformationele veranderingen voor de twee moleculen.

Outlook

Op deze manier, Zengqin Deng en collega's gebruikten single-particle cryo-EM om de structuur te bepalen van integrale membraaneiwitten die doorgaans onbereikbaar zijn met behulp van traditionele röntgenkristallografie. Het is nog steeds een belangrijke technische uitdaging om een ​​bijna-atomaire resolutie te bereiken voor membraaneiwitten van kleine omvang vanwege het lage contrast en de signaal-ruisverhoudingen. Deng et al. verkreeg een 3,5 angstrom resolutiestructuur van een kanaal door een kleine kristallisatiechaperone BRIL te fuseren om de stabiliteit van de anders suboptimale membraaneiwitten te verbeteren om kristalverpakking te bevorderen. Op basis van de geconserveerde kernstructuur, de kanalen waren selectief voor kationen of anionen en ondervonden vergelijkbare conformationele veranderingen in de poort. Het werk bracht een nieuwe klasse van chloridekanalen tot stand om een ​​nieuw raamwerk te vormen voor verder functioneel en mechanisch onderzoek in cel- en structurele biologie.

© 2021 Science X Network