Neutronentechnieken zijn goed voor het bestuderen van lichte atomen zoals waterstof - geweldig voor biologische moleculen die grote aantallen van hen bevatten. Neutronen zijn bijzonder gevoelig voor isotopische substitutie van waterstof (1H) met deuterium (2H) en hierdoor kunnen contrasttechnieken worden gebruikt om moleculen in detail te bestuderen. Voor deze, gebruikers moeten gedeutereerde versies maken van de biologische moleculen die ze willen bestuderen. Echter, deze per-gedeutereerde moleculen zijn zelden verkrijgbaar bij commerciële leveranciers omdat de markt ervoor van beperkte waarde is. Hier wil SINE2020 de leemte opvullen.

Taak 5.2 van het werkpakket Chemical Deuteration is het opzetten van procedures voor extractie, zuivering en analyse van kleine gedeutereerde biomoleculen. Deze moleculen zullen dan beschikbaar zijn voor gebruikers van neutronentechnieken en via de DEUNET-platformpartners. De belangrijkste betrokken biomoleculen zijn fosfolipiden, sterolen (bijv. cholesterol) en sfingolipiden - alle soorten moleculen die in biologische membranen kunnen worden gevonden en daarom belangrijke toepassingen hebben in farmaceutische producten. Lipiden hebben ook een rol in de cosmetica, voedsel- en nanotechnologiesectoren, dus de mogelijkheid om ze te bestuderen met behulp van neutronen zou van onschatbare waarde zijn voor veel onderzoekers en industriële bedrijven.

Krishna Batchu, met Giovanna Fragneto, bij IBL voert het onderzoek voor SINE2020 uit. Het werk heeft zich geconcentreerd op verschillende fosfolipiden, waaronder voornamelijk fosfatidylethanolamine (PE), fosfatidylcholine (PC) en fosfatidylserine (PS). Ze worden bereid met behulp van celculturen van de giststam Pichia pastoris, omdat deze goed werkt voor lipidenextractie en met succes groeit in gedeutereerde media.

Fosfolipiden zijn amfipathische moleculen die bestaan ​​uit een waterminnende kopgroep en twee waterhatende "benen". De "benen" zijn ketens van koolstofatomen die aan waterstof (of deuteriumatomen) zijn bevestigd. Hun samenstellingen in de celmembranen zijn enorm complex met membranen die typisch enkele duizenden chemisch verschillende moleculaire soorten lipiden bevatten. De kettingen binnenin kunnen variëren in lengte, meestal tussen 6 en 24 koolstofatomen, en bevatten tussen 0 en 12 dubbele bindingen tussen de koolstofatomen - het zogenaamde verzadigingsniveau. Hoe meer dubbele bindingen, hoe onverzadigder de keten.

Fosfolipidehomeostase in een biologisch systeem wordt in stand gehouden via drie belangrijke cellulaire processen:1) Biosynthese 2) Hermodellering en 3) Degradatie. In de gistcellen (in de kweek) bestaat een speciale moleculaire machinerie voor het vetzuurmetabolisme die zowel verlenging als onverzadiging van de keten veroorzaakt, gekatalyseerd door respectievelijk elongasen en desaturasen, tijdens het productieproces. Eenmaal gebiosynthetiseerd, hun opname in verschillende fosfolipiden wordt gekatalyseerd door een aantal acyltransferasen, wat leidt tot het bestaan ​​van een groter repertoire van individuele moleculaire soorten. De uitdaging is dat met zoveel variabelen het aantal geproduceerde soorten fosfolipiden enorm is.

Een deel van het project heeft onderzocht hoe groeiomstandigheden het type lipiden dat wordt geproduceerd beïnvloeden. Er zijn geen significante verschillen gevonden die suggereren dat de oogsttijd het lipidenprofiel beïnvloedt, maar er zijn aanwijzingen dat de koolstofbron een effect heeft en dat er meer onverzadiging optreedt als de groei plaatsvindt bij lagere temperaturen.

Als een celcultuur eenmaal is gegroeid, de lipiden moeten worden geëxtraheerd, gescheiden en gezuiverd. Dit is gelukt, voor zowel gehydrogeneerde als gedeutereerde PC, PS- en PE-moleculen, met behulp van een tweestapsproces:een vaste-fase-extractie gevolgd door zuivering via een normale-fasekolom gekoppeld aan een HPLC-systeem. Gehydrogeneerde versies zijn opgesteld om ze te vergelijken met de gedeutereerde soorten en voor aanvankelijke testprocessen om verspilling van duur deuterium te voorkomen.

Nu is de uitdaging om individuele moleculaire soorten te zuiveren, identificeren en analyseren met behulp van een massaspectrometrische benadering. Het uiteindelijke doel is om alle procedures en protocollen voor het produceren van deze gedeutereerde biomoleculen zorgvuldig te documenteren voor toekomstige gebruikers.