Het was meer dan 10 jaar in de maak, maar als het ging om het ontrafelen van de geheimen van de moleculaire structuur van enzymen, doorzettingsvermogen wierp zijn vruchten af. Door het werkpaard cellulose-afbrekende enzymen van twee schimmels te bestuderen en te vergelijken, onderzoekers van het National Renewable Energy Laboratory (NREL) van het Energy Department hebben regio's op deze enzymen vastgesteld die via genetische manipulatie kunnen worden aangevallen om cellulose sneller af te breken.

Nieuw gepubliceerd in Natuurcommunicatie , "Engineering verbeterde cellobiohydrolase-activiteit" beschrijft NREL's langlopende studie van de schimmelcellobiohydrolasen (CBH's) - enzymen die hydrolyse gebruiken als hun belangrijkste chemie om cellulose af te breken - Trichoderma reesei (TrCel7A) en Penicillium funiculosum (PfCel7A). Jaren van nauwgezet onderzoek hebben grote beloningen opgeleverd:het team heeft een beter begrip gekregen van de structuur-activiteitsrelaties van deze enzymen om de beste plaatsen te voorspellen om veranderingen en verbeteringen aan te brengen.

Zowel in de natuur als in industriële processen, enzymen uit deze familie behoren tot de belangrijkste enzymen voor het afbreken van cellulose. Een geprojecteerde 2, cellulose-ethanolfabriek van 000 ton per dag zou mogelijk tot 5, 000 ton enzym per jaar, en de helft van die enzymcocktail zou van deze enzymfamilie kunnen zijn. "Er is de afgelopen decennia een drive geweest om biokatalysatoren van deze belangrijke enzymfamilie te begrijpen en te verbeteren, " zei Gregg Beckham, groepsleider bij NREL en senior auteur van de studie. "Hoe efficiënter het enzym, hoe minder enzym wordt gebruikt, en dus is het proces goedkoper. Echter, we hebben nog een lange weg te gaan om verbeteringen te kunnen aanbrengen in een voorspellende capaciteit."

Vervolgens, in 2005, NREL-onderzoekers Mike Himmel, Steve Decker, en Bill Adney ontdekte een CBH van een andere schimmel, PfCel7A, en ontdekte dat het 60 procent beter presteert dan TrCel7A. "Het verbaasde ons dat dit enzym zoveel beter was dan de industriestandaard, " zei Decker, die de taak leidden nadat Adney NREL had verlaten. "We hebben de afgelopen jaren veel experimenten uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de activiteit echt was. natuurlijk, we wilden weten waarom het beter was."

"Als we de structurele verschillen konden begrijpen, dan kunnen we die informatie mogelijk gebruiken om betere enzymen te maken, wat op zijn beurt zou kunnen helpen de kosten van cellulose-biobrandstof en biochemische productie te verlagen, " zei Beckham. "Gezien de uitdaging om met deze enzymen te werken, het kostte het team van NREL zeven jaar grondig experimenteel werk om de tools te ontwikkelen die nodig zijn om vast te stellen dat er een aantal hotspots op deze twee CBH's zijn die kunnen worden aangepast om ze beter te laten presteren."

Volgens Decker, "Destijds, hulpmiddelen voor genetische manipulatie in Trichoderma waren zeer beperkt, maar we wisten uit eerder werk dat andere gastheren problemen hadden met het tot expressie brengen van deze eiwitten. We zijn eigenlijk helemaal opnieuw begonnen en hebben ons eigen interne T. reesei-systeem van gastheerstammen gebouwd, vectoren, en transformatie- en screeningprotocollen. Vergeleken met goed ontwikkelde systemen zoals E. coli, T. reesei's slechte transformatie-efficiëntie, vervelende selectieprocessen, langzame groei, en lage eiwitopbrengst maakte dit een uitdagende operatie. Elke soort die we hebben gebouwd heeft maanden geduurd, van ontwerp tot eindtest."

De ontdekking ontvouwde zich toen NREL de overeenkomsten tussen TrCel7A en PfCel7A onder de loep nam en vervolgens werkte om de verschillen te isoleren. Beide enzymen hebben een architectuur met drie domeinen:het koolhydraatbindende molecuul dat het aan cellulose hecht; het katalytische domein dat cellulose afbreekt; en de link die deze twee domeinen met elkaar verbindt. Het onderzoeksteam voerde vervolgens experimenten met domeinuitwisseling uit door een chimera-bibliotheek te creëren, dat is een verzameling mutante enzymen die zijn gemaakt van de twee ouderenzymen.

"Met drie domeinen tussen twee ouders, dat maakt in totaal acht combinaties, " zei Beckham. "We hebben de verschillende combinaties getest om erachter te komen op welk gebied het enzym betere prestaties levert, en misschien niet verrassend, achteraf gezien, het is het katalytische domein."

Met die bevindingen de onderzoekers vergeleken vervolgens de katalytische domeinen van TrCel7A en PfCel7A en vonden acht gebieden die anders waren. Doorgaan met het beperken van de mogelijkheden, het team nam de TrCel7A-ouder en bracht wijzigingen aan, een per keer, in die acht gebieden en ontdekte twee belangrijke wijzigingen die ertoe leidden dat TrCel7A bijna op het niveau van de PfCel7A-ouder presteerde.

"Die twee, zeer kleine veranderingen op dit enorme eiwit verdubbelden in feite de prestaties van TrCel7A, " zei Beckham. "Wat dit onderzoekers leert die eiwit-engineering doen op deze ongelooflijk uitdagende enzymen, is dat er zeer kleine veranderingen zijn in dit katalytische domein die kunnen worden gewijzigd om de prestaties van het enzym dramatisch te beïnvloeden, waardoor het in staat is cellulose sneller af te breken, waardoor industriële processen minder enzymen kunnen gebruiken."

"We wisten dat de ontdekking van PfCel7A destijds belangrijk was, maar de weg vooruit was niet helemaal duidelijk, " zei Himmel, de overall projectleider. "We hebben de moeilijkste familie van cellulasen aangepakt om eerst te verbeteren, en zo volgt dat biomassa-afbrekende enzymen uit andere families maximaal actief kunnen worden gemaakt in een meer gestroomlijnd proces, met minder onderzoek en ontwikkeling. Het was de samensmelting van experimentele biochemie en computationele wetenschap die deze studie tot een succes heeft gemaakt Natuurcommunicatie en dat resultaat was alleen mogelijk met duurzame financiering van het Bioenergy Technologies Office."

Het uiteindelijke doel van het NREL-team is om andere onderzoekers te helpen de berg genomics-gegevens te doorzoeken om betere enzymen te vinden, alleen op basis van hun genetische sequentie. "In 10 jaar, het zou zo opwindend zijn om met duizenden enzymsequenties uit deze familie te kunnen gaan zitten en te kunnen voorspellen welke paar je moet proberen, " zei Beckham. "Deze studie is een stap op een zeer lange weg, maar het is een waardig doelpunt."