Onderzoekers van het Max Planck Institute for the Science of Light in Erlangen hebben een techniek ontwikkeld om direct te observeren hoe enzymen en andere biomoleculen hun werk doen, met mogelijk aanzienlijke medische en wetenschappelijke voordelen. Met behulp van deze techniek, zij hebben, voor het eerst met alleen licht en zonder marker, waargenomen conformationele veranderingen in DNA-polymerase, het enzym dat verantwoordelijk is voor het repliceren van DNA. Omdat de techniek ook gebruikt kan worden om te bestuderen hoe enzymen hun werk doen, het zou kunnen helpen bij het identificeren van nieuwe mechanismen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Als biologen door een moderne microscoop kijken, wat ze zien lijkt een beetje op wat je zou zien als je 's nachts langs een snelweg zou kijken:voertuigen zijn alleen zichtbaar door hun koplampen en het is onmogelijk om te zien of de koplampen van een auto of van een vrachtwagen zijn, of een geparkeerde auto zijn deur opent. Momenteel, biologen kunnen alleen indirect zien dat enzymen hun werk doen. Ze hechten fluorescerende kleurstoffen aan afzonderlijke componenten van biomoleculen en bekijken vervolgens de lichtpunten die onder een microscoop bewegen. Ze kunnen heel weinig zien hoe de vorm van het enzym verandert. In aanvulling, als er een kleurstofmolecuul aan vastzit, betekent dit dat het enzym dat ze bekijken zich niet in zijn natuurlijke staat bevindt. Het is niet uitgesloten dat dergelijke kleurstofmoleculen de functie van het enzym kunnen beïnvloeden.

Een team van onderzoekers onder leiding van Frank Vollmer, tot voor kort de leider van een onderzoeksgroep aan het Max Planck Institute for the Science of Light en nu een professor aan de Universiteit van Exeter, heeft, echter, een techniek ontwikkeld waarmee ze enzymen kunnen observeren zonder een fluorescerende marker aan te brengen.

Een nanostaafje concentreert licht op een gebied van slechts enkele nanometers

Hun microscopisch kleine instrument is in feite een sensor op een sensor. Een gouden nanostaafje met een diameter van ongeveer 10 nanometer en een lengte van 40 nanometer is bevestigd aan een glazen microbolletje met een diameter van ongeveer 80 micrometer (1 micrometer =1/1000 millimeter). Een lichtgolf, geproduceerd door een laser, wordt over de binnenrand van deze microbead heen en weer geslingerd. Omdat deze golf de rand van de microbead heel licht overlapt, het interageert met de bijgevoegde nanorod.

Deze interactie begint vrij zwak, maar de microbead werkt als een fluistergalerij:in een rotonde, een woord dat langs de muur wordt gefluisterd, is duidelijk te horen aan de andere kant, omdat de geluidsgolf de kromming van de muur volgt in plaats van zich in alle richtingen te verspreiden. Op dezelfde manier, de lichtgolf die aan de binnenkant van de microbead rond en rond gaat, passeert de gouden nanostaaf duizenden keren in een extreem korte tijd, het versterken van de interactie met de nanorod.

De nanostaaf trekt het licht dat de rand van de microbead overlapt verder naar buiten. Het resultaat is een geconcentreerd lichtgebied zoals een spotlight ongeveer even groot als de staaf, dat wil zeggen slechts een paar nanometer in diameter. Als een enzym of ander molecuul zich vervolgens bindt aan de gouden nanostaaf, het baadt in deze schijnwerpers. Het signaal dat de sensor produceert, hangt af van het molecuul dat in de schijnwerpers staat en hoe het zich binnen dit licht beweegt. Hierdoor kunnen de onderzoekers de bewegingen van een enkel enzymmolecuul onderzoeken en vastleggen.

Verschillende signalen voor verschillende enzymconformaties

De techniek is gebaseerd op een fenomeen dat bekend staat als plasmonics. Toegepast op minuscule metalen structuren zoals nanostaafjes, plasmonics maakt het mogelijk om licht te concentreren op een gebied van slechts enkele nanometers. "Hierdoor kunnen we het licht verkleinen tot de grootte van een enzym, ", legt Frank Vollmer van het Max Planck Institute for the Science of Light in Erlangen uit. En zelfs verder:de onderzoekers in Erlangen zijn er zelfs in geslaagd om hun techniek te gebruiken om individuele ionen te onderzoeken.

In een experiment, de natuurkundigen bevestigden het enzym DNA-polymerase aan hun sensor en probeerden vervolgens vast te leggen hoe het beweegt. DNA-polymerase lijkt op een hand die een pijp vastpakt - de pijp is in dit geval de DNA-streng die wordt verwerkt. Deze "hand" geeft een ander signaal wanneer hij open is en wanneer hij gesloten is, omdat dit de grootte van de overlap tussen de lichtvlek en het enzym verandert. Hierdoor konden de onderzoekers in realtime vastleggen hoe het enzym opent en sluit. "Verdere verfijning van onze techniek zou ons in staat moeten stellen om dingen te doen zoals het direct vastleggen van de synthese van een DNA-streng door het polymerase-enzym, ", legt Vollmer uit. Biochemici zouden dan in realtime kunnen observeren hoe het enzym genetische informatie kopieert en zelfs het signaal van de nanosensor kunnen gebruiken voor DNA-sequencing.

Experimenten met de nieuwe techniek hebben meer kunnen waarnemen dan alleen hoe enzymen bewegen. "We hebben het gebruikt om de temperatuurafhankelijkheid van enzymactiviteit te observeren, ", legt Frank Vollmer uit. Dit biedt een gemakkelijke manier om thermodynamisch onderzoek uit te voeren. Dergelijke onderzoeken kunnen informatie opleveren over kenmerken zoals de activeringsenergie van een enzym, legt de natuurkundige uit. De activeringsenergie is een maat voor de efficiëntie van deze biologische katalysatoren.

De nanosensor kan worden gebruikt om chemische reacties te observeren

Om aan te tonen hoe klein de deeltjes kunnen zijn die kunnen worden gedetecteerd met behulp van een plasmonische nanosensor, de onderzoekers gebruikten het om individuele ionen (elektrisch geladen atomen) te observeren. "We waren verrast dat dit zelfs mogelijk was, ", zegt Vollmer. De zink- en kwikionen die ze gebruikten, zijn slechts ongeveer een tiende nanometer groot - minder dan een duizendste van de golflengte van het gebruikte licht. echter, mogelijk om aan het uiteinde van een nanostaafje een lichtvlek te maken die zulke kleine afmetingen kan aftasten. "Het gaat niet om het identificeren van individuele ionen, " benadrukt Vollmer. De onderzoekers waren in staat om ervoor te zorgen dat precies één ion zich aan het uiteinde van de nanostaaf hechtte door de concentratie van ionen in oplossing te variëren. Door op deze schaal te komen, kunnen biologen de functie van ionenkanalen bestuderen. Ionenkanalen omvatten:bijvoorbeeld, eiwitten ingebed in zenuwcelmembranen die verantwoordelijk zijn voor de signaaloverdracht langs de zenuw.

Het gebruik van de door het team van Frank Vollmer ontwikkelde nanosensor beperkt zich niet tot het visualiseren van biochemische processen waarbij enzymen en andere eiwitten betrokken zijn. Het kan ook worden gebruikt om chemische reacties tussen individuele moleculen en het oppervlak van de gouden nanostaaf te observeren. "Door deze techniek te gebruiken, wij kunnen, bijvoorbeeld, mechanismen van interactie detecteren en analyseren, ", legt Frank Vollmer uit. Het tijdsverloop van deze interacties kan inzicht geven in hoe verschillende moleculen zich binden aan het oppervlak van de gouden nanostaaf.

Om dit aan te tonen, de onderzoekers bestudeerden twee soorten moleculen, een met een aminegroep, een met een thiolgroep. "Het blijkt dat de twee groepen via verschillende mechanismen reageren met het oppervlak van het goud, " legt Vollmer uit. Terwijl de aminegroepen binden aan goudatomen die uit het oppervlak steken, de thiolgroepen binden alleen aan atomen die volledig in het oppervlak zijn ingebed.

De onderzoekers observeerden ook reacties tussen de verschillende moleculen. "Hierdoor kunnen chemici de reactieomstandigheden in realtime testen en optimaliseren, ", zegt Vollmer. Het gebruik van deze gouden nanostaaf-lichtvlek is niet beperkt tot het bestuderen van chemische reacties, het kan echter ook worden gebruikt om ze te besturen. Door de intensiteit van het licht in de geconcentreerde lichtvlek te verhogen, de onderzoekers lieten een kwik-ion binden aan het oppervlak van de gouden nanostaaf. De intensiteit van het licht in de lichtvlek verhoogt de energie van de elektronen in de goudstaaf zodat ze kunnen reageren met de kwik-ionen. Hierdoor ontstaat een stabiel amalgaam van goud en kwik. De twee elementen blijven samengesmolten, zelfs wanneer de lichtvlek verdwijnt, omdat de reactie een relatief stabiele covalente binding tussen een goudatoom en een kwikatoom produceert.

"Het beheersen van reacties en enzymactiviteit op de plasmonische biosensor is een zeer interessant gebied voor toekomstig onderzoek, ", zegt Vollmer. De lichtvlek kan ook worden gebruikt als een optisch pincet om enkele biomoleculen tijdelijk aan de sensor te bevestigen voor optische analyse.

Inzichten in storingen in de machinerie van het leven

De toekomstvisie van Vollmers team is om moleculen - zowel biomoleculen als synthetische moleculen - atoom voor atoom te kunnen scannen. "Door verschillende lichtbronnen met verschillende golflengten en polarisaties te gebruiken, het is in principe mogelijk om de mate waarin het licht het molecuul overlapt te wijzigen en verschillende domeinen van hetzelfde molecuul te onderzoeken, ", legt Vollmer uit. Een moleculaire scanner van dit type zou in staat kunnen zijn om een ​​proces vanuit verschillende hoeken en met zeer korte tussenpozen te observeren. Een kaart met een hoge resolutie van een dergelijk proces zou ons begrip van de moleculaire machinerie aanzienlijk vergroten. Biologen zouden zelfs in detail kunnen observeren hoe dergelijke structuren veranderen in perioden variërend van nanoseconden tot enkele uren.De plasmonische biosensor verhoogt ook de mogelijkheid van een geautomatiseerd laboratorium niet groter dan een vingernagel, die een monster scant, eiwit voor eiwit, ziekte op moleculair niveau te diagnosticeren.

Mocht het in de toekomst mogelijk worden om plasmonische nanosensoren te gebruiken om te zien hoe enzymen van vorm veranderen, dit zou clinici in staat kunnen stellen beter te begrijpen hoe storingen in de machinerie van het leven ziekten zoals de ziekte van Alzheimer veroorzaken, die geassocieerd zijn met veranderingen in de enzymstructuur. Een beter begrip van dergelijke processen zou zelfs nieuwe behandelmethoden kunnen opleveren.