Door John Brennan
Bijgewerkt op 30 augustus 2022

TeerawatWinyarat/iStock/GettyImages

Wetenschappers breken DNA routinematig af in de nucleotidecomponenten om genetische eigenschappen of ziekterisico's te analyseren. Een cruciale stap in de meeste DNA-extractieworkflows is het gebruik van ethanol of isopropanol om nucleïnezuren uit celresten te isoleren. Omdat cellen eiwitten, lipiden en andere verontreinigingen bevatten, is het doel een zo puur mogelijke DNA-oplossing te produceren.

Typische extractieprotocollen omvatten meerdere fasen:cellyse, verwijdering van membraanlipiden en scheiding van DNA van eiwitten, RNA en andere onzuiverheden. Twee veelgebruikte methoden zijn alkalische lyse (voor bacterieel plasmide-DNA) en fenol-chloroformextractie. In beide benaderingen wordt precipitatie met ethanol of isopropanol gebruikt als een van de laatste stappen. Na precipitatie wordt de DNA-pellet geresuspendeerd in water of een zoutarme buffer.

Ethanol als effectief oplosmiddel

Ethanol en isopropanol zijn volledig mengbaar met water, maar hun diëlektrische constanten zijn aanzienlijk lager (water =78,5; ethanol =24,3). DNA heeft een negatieve lading en trekt kationen zoals Na⁺ of K⁺ aan. Omdat ethanol deze ionen minder efficiënt afschermt, is de kans groter dat de DNA-kationcomplexen aggregeren en neerslaan.

Ethanol verbetert de DNA-concentratie

Naast ladingsafscherming vermindert ethanol de oplosbaarheid van DNA door waterstofbruggen met water te vormen, waardoor het aantal beschikbare watermoleculen om het nucleïnezuur te hydrateren wordt beperkt. Dit dubbele effect zorgt ervoor dat DNA samen met positieve ionen neerslaat, waardoor een vaste pellet ontstaat die meer geconcentreerd is dan de oorspronkelijke oplossing. Belangrijk is dat veel medeverontreinigingen niet neerslaan onder dezelfde omstandigheden, waardoor de algehele zuiverheid van het DNA toeneemt.

Belangrijke overwegingen tijdens extractie

De ethanolwassing verwijdert ook verontreinigingen met een laag molecuulgewicht, zoals zouten en wasmiddelen. De keuze van het zout kan van cruciaal belang zijn bij het verwijderen van wasmiddelen zoals natriumdodecylsulfaat (SDS). Kaliumdodecylsulfaat is bijvoorbeeld onoplosbaar en zal neerslaan, dus het gebruik van kaliumacetaat bij alkalische lyse kan SDS elimineren voordat ethanol of isopropanol wordt toegevoegd. Ethanol kan ook RNA neerslaan, hoewel doorgaans een hogere concentratie ethanol nodig is voor optimaal RNA-herstel.