Western blotting is een krachtige techniek die wordt gebruikt om specifieke eiwitten in een monster te detecteren. Het gaat om het scheiden van eiwitten op basis van hun grootte en het vervolgens gebruiken van antilichamen om het gewenste eiwit specifiek te targeten en te visualiseren. Hier volgt een stapsgewijze uitleg van hoe een specifiek eiwit kan worden gedetecteerd in een western blot:

1. Eiwitextractie en bereiding:

- De eerste stap is het extraheren van eiwitten uit het betreffende monster. Dit kan worden gedaan met behulp van verschillende methoden, zoals cellyse of weefselhomogenisatie, gevolgd door centrifugatie om celresten te verwijderen.

- De geëxtraheerde eiwitten worden vervolgens gekwantificeerd, meestal met behulp van een Bradford-test of vergelijkbare methoden, om in de daaropvolgende stappen een gelijke eiwitbelading te garanderen.

2. Eiwitscheiding:

- Het eiwitmonster wordt gemengd met een laadbuffer die een reductiemiddel bevat (bijvoorbeeld bèta-mercaptoethanol of DTT) en een trackingkleurstof (bijvoorbeeld broomfenolblauw).

- Het eiwitmengsel wordt voor elektroforese op een polyacrylamidegel geladen. De gel wordt onderworpen aan een elektrische stroom, waardoor de eiwitten zich scheiden op basis van hun grootte. Kleinere eiwitten migreren sneller door de gel, terwijl grotere eiwitten langzamer bewegen.

3. Eiwitoverdracht:

- Na elektroforese worden de gescheiden eiwitten van de gel overgebracht op een nitrocellulosemembraan of polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan. Dit proces, bekend als eiwitblotting of electroblotting, omvat het plaatsen van de gel en het membraan in een overdrachtsbuffer en het aanleggen van een elektrische stroom.

- Hierdoor worden de eiwitten van de gel op het membraan overgebracht, waardoor een replica ontstaat van de gescheiden eiwitten.

4. Membraanblokkering:

- Om de niet-specifieke binding van antilichamen te verminderen, wordt het nitrocellulose- of PVDF-membraan geblokkeerd met een oplossing die een eiwit bevat, zoals runderserumalbumine (BSA) of magere melkpoeder.

- Deze blokkeringsstap helpt achtergrondsignalen te minimaliseren en verbetert de specificiteit van antilichaambinding tijdens de volgende stappen.

5. Incubatie van primaire antilichamen:

- Het membraan wordt geïncubeerd met een primair antilichaam dat het betreffende eiwit specifiek herkent en eraan bindt. Primaire antilichamen worden doorgaans gegenereerd tegen het doeleiwit of een specifiek epitoop binnen het eiwit.

- Deze antilichamen worden verdund in een geschikte buffer en geïncubeerd met het membraan, waardoor ze zich kunnen binden aan hun doeleiwitten.

6. Wassen:

- Na de incubatie van de primaire antilichamen wordt het membraan grondig gewassen om ongebonden antilichamen te verwijderen en achtergrondsignalen te verminderen. Deze wasstap is cruciaal om specifieke detectie van het doeleiwit te garanderen.

7. Secundaire antilichaamincubatie (geconjugeerd met een reporterenzym):

- Een secundair antilichaam, geconjugeerd aan een enzym zoals mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (ALP), wordt gebruikt om de primaire antilichaam-antigeencomplexen op het membraan te detecteren.

- Secundaire antilichamen zijn soortspecifiek, wat betekent dat ze de primaire antilichamen herkennen en binden die in een bepaalde soort worden geproduceerd (bijvoorbeeld muis of konijn).

- Het enzym-geconjugeerde secundaire antilichaam bindt zich aan het primaire antilichaam, waardoor een complex ontstaat dat signaalversterking en visualisatie mogelijk maakt.

8. Wassen:

- Er wordt nog een wasstap uitgevoerd om ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen en achtergrondsignalen te verminderen.

9. Chemiluminescentiedetectie:

- Voor HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen wordt een chemiluminescent substraat aan het membraan toegevoegd. Wanneer het substraat reageert met HRP, zendt het licht uit.

- Gespecialiseerde chemiluminescentiedetectiesystemen of röntgenfilms worden gebruikt om de uitgezonden lichtsignalen op te vangen en te visualiseren. De intensiteit van het licht komt overeen met de hoeveelheid doeleiwit die in het monster aanwezig is.

10. Gegevensanalyse en interpretatie:

- De ontwikkelde röntgenfilm of digitale chemiluminescentiebeelden worden geanalyseerd om banden of vlekken te identificeren die overeenkomen met het doeleiwit.

- De grootte en intensiteit van deze banden kunnen informatie verschaffen over het molecuulgewicht, de overvloed en post-translationele modificaties van het gedetecteerde eiwit.

Door deze stappen te volgen, maakt Western-blotting de specifieke detectie en analyse mogelijk van een interessant eiwit in een complex mengsel van eiwitten. Het wordt veel gebruikt in verschillende gebieden van biologisch onderzoek, waaronder moleculaire biologie, immunologie en klinische diagnostiek.