Veranderingen die bekend staan ​​als epigenetische modificaties spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van kanker. Het snel en betrouwbaar kunnen analyseren ervan zou een belangrijke bijdrage kunnen leveren aan de verdere ontwikkeling van gepersonaliseerde therapie. Een onderzoeksteam van het Instituut voor Fysiologie van de Universiteit van Freiburg is er nu in geslaagd om de chemische veranderingen in eiwitten die typisch zijn voor epigenetische modificaties te karakteriseren met behulp van nanoporie-analyse. De onderzoekers hebben hun onderzoeksresultaten gepubliceerd in het Journal of the American Chemical Society (JACS ).

Nanoporiën zijn de afgelopen jaren een breed toepasbaar instrument geworden voor de analyse van moleculen. Dankzij hun speciale eigenschappen kunnen ze de structuur van moleculen in fracties van een seconde analyseren:als cilindrisch gerangschikte eiwitten vormen nanoporiën minuscule kanaaltjes met een diameter van slechts enkele miljoensten van een millimeter (nanometer) die in biomembranen kunnen worden ingebed.

"Voor de experimenten zetten we een constante spanning over het membraan zodat ionen uit het omringende medium door de porie stromen. Zo ontstaat er een constante, nauwkeurig meetbare elektrische stroom", legt prof. dr. Jan C. Behrends van de Faculteit der Geneeskunde uit. aan de Universiteit van Freiburg, in wiens laboratorium de nu gepubliceerde experimenten plaatsvonden. Wanneer een molecuul echter naar de porie migreert, wordt de stroom geblokkeerd:hoe groter het molecuul, hoe sterker het ook wordt geblokkeerd.

Een eiwit in de onderzoeksspot:H4

In het kader van de nu gepubliceerde experimenten hebben de wetenschappers van Freiburg zich toegelegd op het onderzoek van het zogenaamde histon-eiwit H4. Dit eiwit is stevig geassocieerd met DNA in alle cellen met een kern en is een van de best onderzochte doelwitten van epigenetische modificaties. Een gebied aan het N-terminale uiteinde van het eiwit wordt in het bijzonder beïnvloed door deze modificaties.

"De eiwitsequentie daar bevat meerdere keren het aminozuur lysine", legt Behrends uit. Aan deze lysinen, die volgens hun positie in de eiwitketen K8, K12 en K16 worden genoemd, kunnen bijvoorbeeld acetyl- of methylgroepen worden gehecht als onderdeel van epigenetische modificaties. Welke chemische modificatie bij welke lysinepositie plaatsvindt, is zeker van medisch belang, zoals de Freiburgse fysioloog aangeeft. "Acetylering op K16 is bijvoorbeeld belangrijk voor de menselijke ontwikkeling, terwijl methylering op K12 een rol speelt bij de ontwikkeling van sommige prostaat- en longtumoren, volgens de laatste resultaten van het Medical Center-University of Freiburg."

Veranderingen detecteren met behulp van een nanoporie

In hun experimenten waren Behrends en zijn team nu in staat om H4-fragmenten met of zonder acetylering duidelijk te onderscheiden, evenals fragmenten met één, twee of drie acetyleringen. Bovendien slaagden ze erin aan te tonen dat de nanoporie die ze gebruikten ook gevoelig was voor de plaats van acetylering:histonfragmenten met een acetylgroep aan K8 blokkeerden de stroom door de porie sterker dan die geacetyleerd aan K12, en deze op hun beurt sterker dan die met een K16-acetylering.

"Dit soort gevoeligheid is verrassend omdat deze fragmenten qua massa en totaal volume identiek zijn", zegt Behrends. De poriestroom blijkt dus niet alleen gevoelig te zijn voor de grootte, maar ook voor de vorm van het molecuul. Het was even gemakkelijk om onderscheid te maken tussen de verschillende varianten van dubbel geacetyleerde histonfragmenten - K8 en K12, K8 en K16, en K12 en K16 - ondanks de identieke massa. H4-fragmenten methyleerden in verschillende mate en op verschillende posities blokkeerden ook de stroom door de porie in verschillende mate, hoewel niet zo duidelijk als de geacetyleerde varianten.

"We hebben voor het eerst door onze experimenten kunnen aantonen dat nanopore-analyse ons in staat stelt om moleculen niet alleen te onderscheiden door hun grootte, maar ook door hun vorm", zegt onderzoeksleider Behrends. Moleculaire dynamische simulaties uitgevoerd door de onderzoeksgroep onder leiding van Aleksei Aksimentiev van de Universiteit van Illinois in de VS - ook betrokken bij het onderzoek - en tonen aan dat een zeer inhomogeen elektrisch veld in de porie een sleutelrol speelt voor dit effect.

Toekomstvisie:geoptimaliseerde medische diagnostiek

Hoewel de sequentiebepaling van DNA met behulp van nanoporiën al is vastgesteld en gecommercialiseerd, is de ontwikkeling van op nanoporiën gebaseerde analyse van eiwitten nog maar net begonnen, zegt Behrends. "De moeilijkheid bij het sequencen van eiwitten is dat dit moleculen zijn met zeer niet-uniforme ladingspatronen." Terwijl DNA, dat negatief geladen is, gericht migreert in het elektrische veld en dus base voor base door de porie kan worden getrokken, bestaan ​​eiwitten uit bouwstenen van aminozuren met verschillende ladingen. Dientengevolge is gerichte beweging in het elektrische veld en aminozuur voor aminozuur "scannen" niet mogelijk. De wetenschappers van Freiburg vertrouwden daarom voor hun experimenten op een andere benadering. In plaats van een porie met een korte vernauwing, zoals gebruikt bij DNA-sequencing, gebruikten ze een op maat gemaakte porie met een soort moleculaire val. "Hierdoor kon het hele eiwitfragment in één keer worden opgevangen", zegt Behrends.

Het is nog niet duidelijk tot welke fragmentgrootte dit type analyse kan worden gebruikt. Aanvullende experimenten tonen echter aan dat de methode ook geschikt zal zijn voor de analyse van de H4-fragmenten die eerder in epigenetisch onderzoek werden gebruikt. Deze bevatten 14 aminozuren in plaats van de tien die hier worden gebruikt, en worden momenteel onderzocht op epigenetische modificaties met tandem-massaspectrometrie, een zeer uitgebreide techniek. De onderzoekers hopen dat de nanoporiën de analyse veel eenvoudiger, sneller en kosteneffectiever zullen maken en dat deze dicht bij de patiënt kan worden uitgevoerd.

De verdere ontwikkeling van nanoporie-analyse van eiwitten voor medische diagnostiek en de implementatie ervan in concrete producten en diensten is ook een van de centrale projecten van het onlangs goedgekeurde BMBF Cluster4Future nanodiagBW, dat Behrends samen met Prof. Dr. Felix von Stetten van de Hahn- Schickard-Gesellschaft, die de leiding heeft over dit project. + Verder verkennen

Nanoporiën kunnen de aminozuren in eiwitten identificeren, de eerste stap naar sequencing